《Science》新作：新冠重症患者I型干扰素活性缺陷及炎症反应研究

——Fluidigm一站式免疫分型试剂盒助力发现更多未知

　　

自从2019年底新冠疫情爆发以来，新冠患者在不同疾病阶段，展现出不同的特征，这预示着患者对于病毒的免疫反应形形色色，各有特征。虽然大多数新冠患者是轻症患者，但是有5%-10%的患者会发展成重症乃至危重症，引发肺炎或者急性呼吸衰竭。从最近法国数据中获悉，新冠患者的死亡率在0.70%，高于季节性流感。重症反应虽然在疾病刚开始就已经发生，但是临床观察其进程分为两个疾病阶段：先是展现出轻症-中症特征，随后在初期症状出现的9-12天后病情发生恶化。目前，关于重症患者的免疫学特征及分子机制依旧知之甚少。日前，巴黎大学Benjamin Terrier等研究者对重症患者是由病毒引发的过度免疫反应导致的这一假说进行研究验证。其工作发表在Science杂志上。

诚如此前报道，研究人员发现重症和危重症患者伴随有淋巴细胞减少症。作者首先选用质谱流式技术对50位新冠患者（15位轻症-中症患者，17位重症患者，18位危重症患者）和18位健康人的血液中的免疫亚群进一步深度分析，发现重症，危重症患者体内的NK细胞和几乎所有的T细胞亚群，尤其是CD8+T细胞亚群百分比出现明显下降。B细胞和单核细胞亚群出现明显上升，浆母细胞在无论轻症，中症，重症及危重症患者体内都出现富集（图一）。随后作者对T细胞和NK细胞的活化和耗竭标志物进行分析，发现在患者体内无论是T细胞还是NK细胞，其活化状态的细胞占比均出现上升，而耗竭状态的细胞占比从轻症到危重症患者体内出现少许上调。

 
图一：健康人，新冠轻症-中症，重症，危重症患者免疫系统概况

除了质谱流式技术以外，作者还对50位患者进行全血转录组分析以及细胞因子测定分析。全血转录组分析采用患者的外周血白细胞进行免疫相关基因的分析，分析结果发现，随着疾病严重程度的增加，固有及炎症反应信号通路均出现激活，与此相反的是，IFN反应在重症和危重症患者体内出现下调。I型IFN在抗病毒免疫中有很重要的作用。研究发现，参与IFN信号通路的基因在重症患者体内出现上调，与此同时，IFN刺激响应基因出现明显下调。跟轻症-中症患者比起来，重症及危重症患者血清中的IFN活性出现明显下调。血浆中IFNα2的低含量跟发展为危重症患者有很强的相关性。有趣的是，作者发现，IFNα在轻症-中症患者体内有很高的合成，而在重症患者体内合成量很多，但是持续时间很短，而在危重症患者体内，很少或者没有合成。而在所有患者体内均内有检测到IFNβ。

作者随后进行细胞因子-趋化因子相关基因分析。发现随着疾病严重程度的增加，两者相关基因均出现明显上调。然而，一些细胞因子，比如IL-6，TNFα的RNA水平和蛋白水平呈现出不一样的变化趋势，这提示血清中的IL-6和TNFα来源很可能是肺损伤细胞和上皮细胞。作者最后想要寻找加重炎症的转录因子，最终发现，重症和危重症患者体内上调的转录因子主要集中在NFκB信号通路中。而NFκB细胞通路的激活可以导致固有免疫活化受体（PAMP和DAMP）的过度激活。疾病的加重伴随着固有免疫细胞：中性粒细胞和单核细胞在肺中的大量浸入。针对这两个亚群的细胞因子分析发现，中性粒细胞趋化因子CXCL2在血清中没有出现上调，但是其受体CXCR2在重症及危重症患者体内出现显著上调。单核细胞趋化因子CCL2和其受体CCR2在患者体内均出现上调，与此同时，循环中的炎症反应相关单核细胞数量出现下降，这预示着CCL2、CCR2影响受损伤的肺中单核细胞的趋化作用。

综上，这项工作发现新冠患者体内存在各级免疫级联反应，这些反应即可由PAMP激活也可由DAMP激活。此外，I型IFN缺陷是危重症患者的一个特征，据此推测，今后可能可以通过IFN干扰或者靶向IL-6、TNFα抗炎症治疗来缓解疾病严重程度。此项工作具有很好的临床预示性，为今后的治疗方向提供了理论基础。

值得一提的是，在本研究最一开始，针对新冠患者免疫系统整体深度分析的实验中，所采用的是Fluidigm公司推出的一站式免疫分型试剂盒（Maxpar Direct Immune Profiling Assay）。该试剂盒含有30种抗体，可以利用仅仅300ul全血或者3X106的PBMC，即可对37种免疫亚群进行深度分析，非常适用于临床样本全面深度的免疫分析研究（图二）。试剂盒采用抗体冻干粉的形式，简化整个实验流程的同时，保证site to site，run to run，lot to lot的可比性，其稳定性经过包括本研究作者在内的众多用户认可和实验验证。该试剂盒是为多地点，多时间点的课题量身定做。

 
图二：MDIPA试剂盒利用30种标志物进行37种免疫亚群的全面分型

参考文献：
Jérôme Hadjadj, Nader Yatim, Laura Barnabei et al. Impaired type I interferon activity and inflammatory responses in severe COVID-19 patients. Science (2020).

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