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另辟蹊径优化WB,轻松检测各种分子量的蛋白质

【字体: 时间:2020年07月06日 来源:生物通

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  Western blotting大概是检测和鉴定蛋白质的最常用方法,几乎每个实验室都会用到吧。然而,如何提高检测灵敏度,同时兼顾高分子量和低分子量蛋白的表达,这仍然是个问题。

Western blotting大概是检测和鉴定蛋白质的最常用方法,几乎每个实验室都会用到吧。然而,如何提高检测灵敏度,同时兼顾高分子量和低分子量蛋白的表达,这仍然是个问题。

近日,美国密西西比女子大学的研究人员在《BioTechniques》杂志上发表了题为“Optimization of western blotting for the detection of proteins of different molecular weight”的文章,对western blotting方法进行了优化。

虽然western blotting是一种相当成熟的方法,但在检测特定的蛋白质时,还需要各种优化。在该研究中,研究人员主要关注三个变量,包括转印膜的类型、封闭液的类型以及Towbin转移缓冲液(TTB)中的甲醇浓度。

他们利用三种不同分子量的膜蛋白来测试这三个变量,具体包括CFTR(MW 170 kDa),这种突变的蛋白破坏多个器官上皮细胞中的氯离子通道功能,导致囊性纤维化;LAMP1(MW 110 kDa)是一种高度糖基化的溶酶体膜蛋白;而Rab11a(MW 25 kDa)则属于GTP结合蛋白超家族,在新合成蛋白的内吞和转运中起作用。

转印膜和封闭液对实验的影响

为了尽量减少实验差异,研究人员将相同裂解液放在一对预制胶上进行电泳,并同时进行蛋白转印。一块凝胶转移到NC膜上,而另一块转移到PVDF膜上。之后将转印膜切成小条,与不同的封闭液一起孵育。封闭液有多种,包括单一蛋白(BSA和明胶)和天然的蛋白混合物(blotto脱脂奶粉和FBS胎牛血清)。此外,他们还采用了一种独特的封闭混合物,由BSA、FBS、明胶和blotto组成。

人们通常建议用PVDF膜来转印高分子量蛋白,但在这项研究中,CFTR蛋白在NC膜上产生了更强的信号。结果显示,无论使用哪种封闭液,CFTR蛋白在NC膜上产生的信号都比PVDF膜更强。同时,单一蛋白封闭液似乎不如复杂蛋白有效,如图1中CFTR的C条带所示。值得一提的是,封闭混合物的封闭效果“秒杀”其他。


图1. 不同的膜和封闭液对CFTR信号的影响

TTB中的甲醇浓度对实验的影响

基于上一个实验的结果,研究人员采用NC膜和封闭混合物来进行下一组实验,以确定甲醇浓度对不同大小的蛋白质转移及其信号的影响。由于脱脂奶粉是许多实验室广泛采用的封闭液,所以他们也将其纳入实验,与封闭混合物进行比较。

在蛋白质的转印过程中,甲醇起着关键的作用。它能够从蛋白分子上解离SDS,从而提高蛋白与转印膜的结合能力。不过,对于高分子量蛋白,有文献称甲醇是不必要的。以CFTR蛋白为例,研究人员未观察到甲醇对CFTR信号的影响(图2)。不过,对于中等大小的蛋白(LAMP1)和小蛋白(Rab11a),需要10-20%的甲醇才能获得更强信号(图3和图4)。


图2. 脱脂奶粉和封闭混合物对CFTR信号强度的影响


图3. 脱脂奶粉和封闭混合物对LAMP1信号强度的影响


图4. 脱脂奶粉和封闭混合物对Rab11a信号强度的影响

此外,他们还发现,对于所有蛋白质(无论其分子量如何),封闭混合物产生的信号都比blotto脱脂奶粉强。有趣的是,对于Rab11a,即使甲醇不存在,封闭混合物也能产生信号,而且比20%甲醇+脱脂奶粉组合的信号强几倍。如此看来,封闭混合物的使用能够减少TTB中的甲醇用量。

综合以上结果,作者认为,在western blotting中使用NC膜和封闭混合物,能够获得很强的特异性信号。转印缓冲液中甲醇的存在似乎对高分子量蛋白几乎没影响。对于中小分子量的蛋白,较低浓度的甲醇(10%)足以产生几乎最强的信号。因此,人们可以减少甲醇这种有毒溶剂的用量,而不会影响特异性的信号。

他们建议大家在western blotting中使用封闭混合物来增强目标蛋白的信号。这种增强作用有助于低丰度蛋白的检测。即使低丰度蛋白不愁检测,这种调整也能够减少抗体用量,以及减少或避免甲醇的使用。无论从成本考虑,还是从健康考虑,这都是一件好事。(生物通 薄荷)

原文检索

Optimization of western blotting for the detection of proteins of different molecular weight

BIOTECHNIQUES VOL. 68, NO. 6 REPORTS

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