质谱流式在外泌体研究中的应用

几乎所有种类的细胞在正常及病理情况下，都可以产生并向外分泌外泌体。外泌体是直径为30-150nm的小膜泡，运载复杂 RNA 和蛋白质等“货物”，充当细胞间通讯的媒介，在细胞长距离及短距离通讯中均起到很重要的作用。其作用参与到多种生物学过程中，比如免疫反应，抗原提呈，细胞分化，血管生成，以及肿瘤细胞迁移，生存和侵袭等。由于外泌体的以上特性，它是理想的小分子药物载体，目前应用在许多疾病治疗中，比如癌症治疗及中枢神经疾病等。然而，迄今为止，关于外泌体的研究虽多，但是大多集中在组织或器官层面，而组织中含有多种细胞类型，对于哪些细胞接收外泌体无法进行精准定位。因此在单细胞层面对外泌体进行研究具有重大的意义。广州医科大学王金恒利用质谱流式技术，将金属标签标记在外泌体上，首次实现体内单细胞层面对外泌体的研究。其研究于今年5月发表在Biomaterials杂志（IF = 10.273）上。

在文章最开始，作者首先验证方法的可行性。采用小鼠的骨髓基质细胞分离出外泌体后，采用电转的方法，将PI转入到外泌体中，此后在内吞了外泌体的肿瘤细胞及小鼠初级骨髓细胞中，均发现了PI信号。这说明外泌体成功介导了PI的转运。之后，作者用质谱流式系统对该肿瘤细胞进行检测，发现I127信号明显升高。这说明，利用质谱流式进行外泌体接收细胞检测的方法没有问题。此后，作者进一步验证I127, Rh103, Ir193 和 Pt194这四种金属是否适用于这一方法，结果很稳定，方法基本建立。

确认方法可行后，作者将含有DID和DIR的外泌体静脉注射到小鼠体内，过24小时后观察两种染料在小鼠体内的分布，结果显示，在肝脏，脾脏处有大量的染料分布，脊柱，胫骨和股骨处有少量染料分布。这说明，静脉注射的外泌体主要运送到肝脏和脾脏，少量运送到脊柱，胫骨和股骨。将组织单细胞化后分析发现，单核细胞内的DID和DIR含量较多，淋巴细胞内的含量较少，这说明跟淋巴细胞比起来，单核细胞会内吞更多的外泌体。

随后作者采用质谱流式对免疫细胞亚群进行进一步细致研究。对小鼠静脉注射含有DDP染料的外泌体4小时后，进行解剖。取出肝脏，脾脏和股骨，进行单细胞化分离。之后采用含有13种蛋白标志物的panel对细胞进行标记。结果用viSNE进行分析，可同时展示T，B，MDSC，巨噬细胞，DC，造血前体细胞，以及非免疫细胞对外泌体的摄入情况。比对后发现，巨噬细胞和非免疫细胞（包括肝实质细胞，血管和基质细胞）对外泌体的摄入明显多于其他种类的免疫细胞（图一）。

图一：质谱流式对摄入外泌体的免疫细胞亚群细致分型。

外泌体的特性决定了它是一种很好的药物载体，目前已应用于癌症的给药治疗。作者随后研究了何种给药方式具有更好的效果。小鼠移植肿瘤两周和四周后，作者分别采用静脉和瘤内的方式给小鼠注射外泌体。经过24小时后发现，静脉注射的外泌体依旧主要分布于肝脏，脾脏和股骨处，但是瘤内注射的外泌体主要分布于肿瘤组织及癌旁组织中，这说明，采用外泌体给药，瘤内注射的方式会有更好的给药效果。肿瘤组织中同时含有肿瘤细胞和免疫细胞，采用质谱流式技术进行单细胞水平分析后发现，Pt194主要分布在非免疫细胞中，这说明，跟免疫细胞比起来，肿瘤细胞会摄入更多的外泌体（图二）。这个发现非常让人振奋，这说明采用外泌体给药主要会由肿瘤细胞摄入，会达到更好的肿瘤杀伤效果。随后的体内肿瘤治疗实验也展示出相同的结论。作者采用外泌体运载DDP治疗4T1肿瘤，结果发现与单纯注射外泌体相比，实验组的肿瘤大小和重量均出现明显下降，并且这种治疗方式没有引起心脏，肺以及肾脏的重量增加，这进一步说明外泌体给药的精准度及低副作用。

图二，外泌体给Pt194在肿瘤组织中的分布。

在这篇研究中，作者利用质谱流式技术，在小鼠模型中，对外泌体运载Pt194治疗肿瘤进行了细致的研究。研究发现与静脉注射相比，瘤内注射外泌体具有更好的药物肿瘤聚集效果，并且肿瘤细胞对外泌体的摄入量远高于免疫细胞，这预示着外泌体给药的肿瘤杀伤更有针对性，效果更好。体内肿瘤实验进一步证明，瘤内注射外泌体后，对于心脏，肺，肾脏等的影响很小，更进一步说明这种给药方式的低副作用。这些发现具有很好的临床启示意义。

广州医科大学的王金恒实验室今年以来利用质谱流式发表文献收获颇丰，迄今为止，他利用质谱流式技术已发表四篇文献，期待更多佳作降临！

参考文献：
JH.Wang，CG. Tu，H. Zhang et al. Loading of metal isotope-containing intercalators for mass cytometry-based high-throughput quantitation of exosome uptake at the single-cell level. Biomaterials (2020)

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