MMI激光显微切割技术在肠道疾病中的应用

文章主要利用激光显微切割系统获取人结肠上皮单层细胞，并通过转录组学进行数据分析，发现活动性炎症IBD患者IEC可以分泌干扰素刺激基因15蛋白（ISG15），且表达水平比非炎症IBD患者高，对研究炎症性肠道疾病的机制和相关治疗手段有重要作用。

2020年2月5日，由Ann Elisabet Østvik等人在著名期刊《OXFORD》上发表了一篇名为“Intestinal Epithelial Cells Express  Immunomodulatory ISG15 During Active  Ulcerative Colitis and Crohn’s Disease”的文章，该文章主要利用激光显微切割系统获取人结肠上皮单层细胞（Intestinal Epithelial Cells，IEC），并通过转录组学进行数据分析，发现活动性炎症IBD（Inflammatory Bowel  Disease，IBD）患者IEC可以分泌干扰素刺激基因15蛋白（ISG15），且表达水平比非炎症IBD患者高，对研究炎症性肠道疾病的机制和相关治疗手段有重要作用。

肠上皮细胞能够分泌细胞因子，将免疫细胞募集到粘膜并调节免疫反应，从而驱动炎症性肠病的炎症。其中，炎症性肠炎（IBD）包括溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis ，UC）和克罗恩病（Crohn’s Disease，CD）。

干扰素刺激基因15蛋白（ISG15）是一种类泛素蛋白，可在干扰素刺激下由ISG15基因编码产生。ISG15及其类泛素修饰系统参与免疫应答，是干扰素发挥抗病毒效应和炎症调节的重要途径。

但在炎症性IBD中，患者来源的IEC发挥着什么样的作用，ISG15又是如何对IBD进行调控的机制尚不清楚。因此，这篇文章对天然免疫和IEC特异性模式识别受体（Pattern Recognition Receptor，PRR）信号如何与活动性IBD患者结肠上皮细胞中观察到的增强的I型干扰素（IFN）基因标签有关，特别是针对分泌型泛素样蛋白ISG15做了研究。

实验方法

这篇文章主要通过转录组学，免疫组化，免疫蛋白印迹等方法检测全黏膜活检组织、显微解剖的人结肠上皮内层，HT29人肠上皮细胞、经PRR配体和细胞因子处理的3D原代结肠细胞模型中的基因和蛋白质表达。 通过多重趋化因子谱和ELISA，在人外周血单核细胞（PBMC）中检查IEC分泌的细胞因子的作用。

MMI激光显微切割在其中的应用

文章先通过微阵列基因检测对非IBD活检组织的对照组、非活动性和活动性的UC、非活动性和活动性CD的肠粘膜活检组织进行分析，结果发现干扰素刺激基因相关基因ISGs在活动性肠炎的黏膜活检组织中表达水平显著上调，结果如下图1。

接着为了进一步验证ISGs是否由IEC产生，通过MMI激光显微切割系统获得活动性炎症IBD、非炎症性IBD和非IBD（对照组）结肠上皮单层细胞，每个样品组取大约10000个上皮细胞（1mm²），后经处理后进行RNA-seq，得到结果如下图2。

“The microdissection was performed on an MMI CellCut LCM microscope [MMI CellCut on Olympus IX71].”

图 1

图 1.微阵列基因检测对来自非IBD对照（NC）、非活动性溃疡性结肠炎（UCi）、活动性溃疡性结肠炎（UCa）、非活动性克罗恩病（CDi）、活动性克罗恩病（CDa）结肠粘膜活检组织中的I型IFN刺激基因ISG的分析结果。结果表明，I型IFN刺激基因ISG在活动性溃疡性结肠炎活检结肠粘膜组织中高表达。

图 2

图 2.LCM与RNA-seq 分析活动性IBD结肠上皮细胞中ISG的表达。

图A为激光显微切割获得的29个结肠上皮单层细胞样品的RNA-seq结果。热图显示的是活动性炎症IBD（n=12）显微切割上皮单层细胞中ISG基因表达与未发炎IBD和正常对照组（n=17）的上皮单层细胞ISG基因表达的log2比值。

B-E显示的免疫组化实验结果，在知道ISG15与IBD相关免疫活动相关的基础上，进一步确定pSTAT1、ISG15蛋白、ISG15结合受体CD11a在结肠黏膜活检组织中的定位。

结果发现，ISGs可以由活动性炎症IBD患者IEC中产生，同时在活动性炎症IBD表达水平比非炎症性IBD和对照组的高，且IHC的结果与RNA-seq的结果一致。

后续，文章还对HT29细胞和3D原发性结肠模型进行了IFN I型信号通路的诱导，进而检测ISGs在IBD模型与非IBD模型中的表达。结果发现，ISG15可以通过JAK1-pSTAT-IRF9依赖性和非依赖性途径从HT29细胞和3D原发性结肠中表达和分泌。

因此，这篇文章主要研究了天然免疫如何通过PRR信号调节活动性IBD，以及ISGs的表达对肠道炎症的调节作用。通过结合人类结肠黏膜活检和显微切割结肠上皮单层细胞的转录组的检测，以及对人类结肠细胞系和原发性3D细胞模型的研究，发现TLR3配体poly[I:C]在IECs中诱导了I型IFN应答，增强了pSTAT1、IRF9和ISG15蛋白的表达。表明poly[I:C]诱导的游离ISG15的表达和分泌可能独立于IFN自分泌/旁分泌，特别是在人类结肠中，这也可能发现了IBD内源性DAMP受体分子诱导炎症的机制。结果表明ISG15在细胞外刺激后可以从原发性IEC中分泌出来，ISG15可能成为IBD免疫治疗的新的候选靶点。

文章中所使用的对人结肠上皮单层细胞进行激光显微切割的系统，是来自德国MMI的激光显微切割系统，它可以直接切割目的位置的组织或细胞，继而通过RNA-seq等，获得较原始、较真实的转录组学数据，具有较高的切割效率和收集成功率。

Western blotting

“Images were obtained with LI‐COR Odyssey Fc and analysed using Image Studio Software （LI‐COR）.”

此外，文中进行蛋白检测时所用的蛋白成像仪是LI-COR公司的Odyssey Fc，它具有动态范围广、重复性好、定量准确、背景低、灵敏度高等优点，兼具近红外荧光成像和化学发光成像功能。

德国Molecular Machine & Industries (MMI)是专门致力于将显微操作技术与高精度激光技术相结合应用于生命科学领域的一家专业公司，其标志性产品MMI CellCut激光显微切割系统具备以上所有的设计优势，保证尽可能高的收集效率。另外，其CellEctor单细胞分选系统也是目前世界上性能优异的单细胞分离系统。

基因有限公司作为一家专业性的生命科学仪器、试剂供应商，自1992年成立以来一直秉承着“Let Professionals Serve Professionals”的宗旨，力求将最先进的技术方法推荐到国内，为广大客户提供包括技术咨询、产品选配、售后培训及维护的专业服务体系，并作为MMI全国性代理商，可为感兴趣的客户提供专业的产品咨询、技术答疑及联系试用等，欢迎大家前来咨询。