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0202年了,不会还不知道Iso-Seq全长转录本测序的价值吧?

【字体: 时间:2020年08月19日 来源:基因有限公司

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  回顾那些转录组测序技术的发展史,我们不难看出PacBio高准确度全长转录本测序Iso-Seq在RNA的相关研究方面,起到了重要的作用,具有不依赖于参考基因组,无需组装,直接反映了转录本亚型全貌的特点。

什么是转录组学?

基因组学的发展彻底改变了我们对科学的理解,随之而来的遗传变异与功能基因的研究促使了转录组学技术需求的激增。尽管一般生物的体细胞几乎都共享了同一套基因组DNA,但在不同的时期,不同的器官组织中,由DNA不同区域转录形成的RNA再经过不同的加工方式,最终所发挥的功能则不尽相同。

在基因组测序技术尚未普及之前,就已经开始使用诸如Northern印迹法、以及微阵列芯片等的杂交的方式,来检测基因的表达。尽管技术上对RNA的测量提供了严格的方法,但却往往局限于检测已知的转录本。并且不同转录本亚型(Transcript Isoform)之间的细微差异也往往难以解读。

随着NGS测序技术的发展,生物学能够以所有基因的表达为研究对象,这就不仅仅是已知基因了,也可以检测过去未知的基因及其表达。因此对生物体转录组的鉴定也随着NGS技术发展的产生了巨大飞跃。今天,我们将这种方法称之为RNA-seq。在大数据的时代,这一具有大量信息的方法也迅速替代了微阵列芯片技术。

了解基因的表达情况对阐明生物学过程所达到的结果至关重要,而这并不仅仅是简单的对基因组编码基因的研究,也包括了在特定时间或特定组织细胞中开启的基因表达活动。但尽管目前RNA-seq技术广泛应用,但在研究完整的转录本信息时,依然依赖于将碎片化的RNA序列进行组装。无论怎样,这样的组装方式所得到的结果,其准确性都令人堪忧。特别是对于功能复杂的真核生物而言,由于受到了可变剪接的影响,一个基因往往会形成多个转录本亚型,这样的组合采用短读长拼接的方式,是无法通过组装来展现其全貌的。

几年前,在Mendelspod网站的一次采访中,斯坦福大学基因组学家Mike Snyder这样描述了RNA-seq的过程:“我们提取RNA,将其撕碎成小片段,然后再试着将它们重新组装在一起,首先是为了看转录组的大致情况。然而实际上很难,我们连如此的拼图都难以弄清具体哪些是属于同一部分,也就是同一个转录本。(1)

Ian Korf博士发表在Nature Methods的一篇文章中,同样提出了类似的观点。他认为RNA-seq就好比将用碎纸机粉碎后的杂志文章,再重新整理拼贴成原文。因而可以说,在使用RNA-seq技术时,需要进行大量的计算推断以辅助分析。(2)

长读长测序技术捕获全长转录组

深入的生物学研究需要的不仅仅是RNA-seq,还迫切的需要读取整个全长转录本亚型的特定方法。而这一应用,以单分子实时(Single Molecule, Real-Time,SMRT)测序为特点的PacBio长读长测序技术,真正做到了。

利用SMRT测序技术,研究人员可以生成高准确度长读长的HiFi reads,数十kb的读长在一次测序中足以读取大多数转录本。并且无需下游的生物信息学组装,在没有参考基因组的条件下,完全能够进行转录本亚型的全长测序。这一用于RNA全长转录本测序的单分子长读长测序技术,也被正式的命名为Iso-Seq。Iso-Seq不仅可以用于转录组的探索与发现,并也能够以靶向的方式对单个基因进行研究。


HiFi reads可跨越全长转录本的所有外显子连接点,因而测序不再需要进行转录本组装。

当科学家开始将SMRT测序技术用于转录组相关的研究项目时,呈现了一个共同的画面——即便是已经获得了丰富转录本鉴定结果的组织细胞,也在Iso-Seq技术下呈现出了比以往的观察更为丰富的转录本多样性。很明显,这是由于过去NGS短读长技术导致无法具体而直接的呈现转录本异构的多样性而带来的缺憾。

例如北京大学分子医学研究所张岩博士及其研究团队,2019年在Nature Cell Biology发表的文章,采用SMRT测序技术和定量质谱相结合,首次发现CaMKII-d9而不是以前广泛认为的d2和d3,是人类心脏中最丰富的可变剪切体。(3)

然而,Iso-Seq不仅仅用于可变剪接……

除了用于揭示由可变剪接带来的转录本多样性外,Iso-Seq方法对于理解可变聚腺苷酸化,基因注释,融合基因转录本,转录本亚型变异的定相(Phasing)以及长链非编码RNA也十分重要。以下是有关Iso-Seq方法如何更进一步用于转录组研究的一些示例。

Poly-A的可变性研究

将可变的聚腺苷酸motif与特定的转录本亚型相关联,以确定它们在农业性状中的重要作用。


用SMRT测序技术鉴定高粱基因中检测到的多样性剪切位点(4)

基因组注释

获得了包括在组装中丢失的基因在内的完整的猪转录组信息。


Iso-Seq方法验证了已知基因,以及在基因组注释中弥补了猪基因组组装所丢失的信息(5)

融合基因表达的转录本

在临床相关基因中发现新的融合转录本,以了解疾病的致病机理。


Iso-Seq方法揭示了发生了IGH与DUX4基因的融合的功能性基因Igμ的序列结构,以及含有IGHM外显子的反义DUX4转录本。(6)

鉴定等位基因的单体型表达

单分子全长转录本测序所获得的单倍型特异的转录本亚型,能够准确评估等位基因的不平衡表达,可用于研究遗传或表观遗传致病性转录本的分子机制,又或者是将表达的多态性与动植物的杂种优势进行联系。


由于高准确度的全长转录本测序体现了基因组中SNP的单体型信息。在子代中不同基因的表达即可通过这一特点来进行等位基因不平衡表达的分析,例如PB.16588(Zm00001d037529)基因在B73和Ki11中均表达。 但是,在F1杂种中,仅表达来自母本的等位基因。(7)

长链非编码RNA的研究

识别长链非编码RNA,以更全面的角度了解转录和翻译调控


使用SMRT测序在短小隐孢子虫中鉴定到的lncRNA的长度分布。(8)

Iso-Seq全长转录本测序为转录组的相关研究带来了更多的可能,除了以上所提到的一些应用案例,在环形RNA的研究,宏转录组学方面也有着喜人的成绩。在不同领域的相关应用中,通过Iso-Seq高准确度全长转录本测序的方法,能够帮助科学家们更深入的了解与探索人类疾病的发生发展,以及生理过程,又或者是农业相关学者、动植物学家等更好的进行相关研究,以促进农业或相关生物的保护工作。

参考文献

1. https://mendelspod.com/podcast/short-read-sequencing-not-task-characterizing-transcriptome-says-mike-snyder-stanford/
2. Korf, Ian. "Genomics: the state of the art in RNA-seq analysis." Nature methods 10.12 (2013): 1165-1166.
3. Zhang, M., Gao, H., Liu, D. et al. CaMKII-δ9 promotes cardiomyopathy through disrupting UBE2T-dependent DNA repair. Nat Cell Biol 21, 1152–1163 (2019).
4. Wang, B., et al. (2018) A comparative transcriptional landscape of maize and sorghum obtained by single-molecule sequencing. Genome Research, 28(6), 921-932.
5. Warr, A., et al. (2020) An improved pig reference genome sequence to enable pig genetics and genomics research. GigaScience, 9, 1-14
6. Tian, L., et al. (2019). Long-read sequencing unveils IGH-DUX4 translocation into the silenced IGH allele in B-cell acute lymphoblastic leukemia. Nature Communications, 10(1), 2789.
7. Wang, B., Tseng, E., Baybayan, P. et al. Variant phasing and haplotypic expression from long-read sequencing in maize. Commun Biol 3, 78 (2020).
8. Teng, K., et al., (2019) PacBio single-molecule long-read sequencing shed new light on the complexity of the Carex breviculmis transcriptome. BMC Genomics, 20(1), 789.

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基因有限公司作为PacBio公司在中国区的独家代理商,自2011年以来将PacBio第三代单分子实时测序技术引入国内,一直为国内用户提供专业的三代测序系统的安装培训,技术支持,应用培训与售后维护工作,赢得客户的一致好评与信任。基因有限公司将一如既往的支持越来越多的PacBio用户。

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