细胞周期分析的一些经验分享

细胞周期失调是癌症的经典特征，会导致细胞无限制增殖。因此，研究人员对此过程开展了广泛研究，希望开发出有效的治疗方法。人们大多采用流式细胞术，通过DNA结合染料对细胞周期进行监控。

在细胞周期的分析过程中，大家考虑的因素往往是选择哪种染料，以及是否需要检测其他的标志物。本文讨论了细胞周期分析的一些经验，也介绍了一些新型工具，有望带来更多的数据和信息。

选择合适的染料

Hoechst、DAPI和PI（碘化丙啶）等经典染料目前仍然广泛用于细胞周期的分析，但也涌现出一些新型的染料。这些染料具有较窄的发射光谱和较低的细胞毒性，让人们在设计流式实验时具有更大的灵活性。

Abcam的资深科学家Saeeda Bobat博士称：“DNA结合染料的作用原理在于它们是化学计量的。这意味着它们的结合与每个细胞中的DNA数量成正比。目前的染料包括：单嵌入剂（如PI）、双嵌入剂（如YOYO）和小沟结合染料（如DAPI）。选择哪种DNA结合染料，在很大程度上取决于实验的设置和目的。”

安捷伦的流式应用开发科学家Lauren Jachimowicz解释说，染料对DNA的特异性非常重要，并举例说明了PI在细胞周期分析中的应用。“由于PI与所有核酸结合，因此染色缓冲液中应包含RNase A，以降解存在的RNA，”她说。在某些情况下，染料的选择受到DNA序列的影响。例如，DAPI优先结合富含AT的区域。

Jachimowicz认为：“在选择DNA结合染料时，另一个要考虑的因素是固定剂的类型。对于细胞周期分析而言，乙醇固定优于甲醛固定，因为甲醛诱导的交联会破坏染料与DNA的结合。不过，如果你打算对其他目标进行染色，则需要确认准备使用的抗体和荧光染料是否与乙醇固定兼容。”

开发出适用于活细胞研究的染料是DNA染色的重要进展之一。Bobat表示：“活细胞染色的优势在于，它可以根据DNA含量对细胞进行分选，然后再进行下游处理。尽管目前只有诸如Vybrant™ DyeCycle™染料的新一代产品能够做到，但在活细胞上开展细胞周期分析，这种能力让人们有望实现更长期的研究。”

与其他标志物相结合

正如前文所述，利用流式细胞术分析细胞周期的同时还需要监控DNA以外的其他靶点。“如果要分析异质性细胞群，而不是细胞系，则必须对其他参数进行染色，”Bobat谈道。“例如在免疫表型分析中，你也许想鉴定中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的亚群，并分别测定其DNA含量。”

“另外，你可能想比较静息（G0）和增殖（G1）细胞，它们在DNA含量上无法区分。这时可以将DNA分析与细胞周期标志物的染色结合起来，比如对细胞周期蛋白D1和E进行染色（静息细胞为阴性），或者利用Pyronin Y来监控RNA水平（静息细胞的RNA表达下调），”Bobat补充说。另一种常见做法是对磷酸化的组蛋白H3进行染色，以区分M期和G2期的细胞。

对于流式实验而言，精心优化的实验方案是至关重要的。一些久经考验的最佳做法能避免doublet，因为如果两个处于G1期的细胞同时通过激光，它们可能会被误认为是G2期或M期的单细胞。

Bobat表示：“在染色之前可通过尼龙网滤器来过滤细胞，从而去除细胞团块。此外，为了确保单细胞悬液，可在样本缓冲液中加入EDTA以减少细胞间的粘附，同时避免剧烈的离心。”当分析以高流速进行时，发生doublet的可能性会增加，因此他建议适当减慢流速，尽管这会增加分析时间。

Jachimowicz认为：“通过对前向散射高度（FSC-H）和前向散射面积（FSC-A）作图，可以排除doublet。与手动设门分析相比，基于软件的自动化分析可提供更准确的数据解释，但需要选择正确的模型。自动化分析的两种主要算法是Watson Pragmatic和Dean-Jett-Fox（DJF）。安捷伦的NovoExpress软件可同时提供这两种算法，并自动适应正常和复杂的S相分布。”

成像流式细胞术

尽管流式细胞术已被公认为是细胞周期分析的金标准，但成像流式细胞术最近在这一领域也得到了广泛的应用。ChemoMetec的研发负责人Søren Kjærulff博士认为，其主要原因是成像流式细胞术能够将细胞DNA含量的定量与形态的鉴定结合起来。利用成像流式细胞仪来观察DNA以及多个标志物的亚细胞定位，研究人员能够获得更多的线索，而不会影响单细胞分析能力。

“成像流式细胞术将光学显微镜和流式细胞术的优势融合在一起，”他说。“虽然光学显微镜是一种强大的技术，但它要求将细胞附着在固体表面，因此限制了可分析的细胞数量。相反，流式细胞术可以分析悬液中的大量细胞，但会丢失空间背景。通过成像流式细胞术来进行细胞周期分析，研究人员可快速分析大量细胞，并根据形态学结果进行证实。”