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In-Cell Western——高通量快速的细胞蛋白检测方法

【字体: 时间:2020年08月03日 来源:基因有限公司

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  Western Blot是分子生物学实验中非常经典的技术手段,但是也会有通量不高,重复性、实验效率低等问题,今天我们给您介绍一种:高通量、高重复性、定量更准确的Western Blot方法--In-Cell Western。

Western Blot是分子生物学实验中非常经典的技术手段,但是也会有通量不高,重复性、实验效率低等问题,今天我们给您介绍一种:高通量、高重复性、定量更准确的Western Blot方法--In-Cell Western。

01 In-Cell Western 实验是什么

In-Cell Western 是由LI-COR公司开发的一种直接在微孔板内(96/384孔板)对细胞内目标蛋白进行定量免疫荧光检测的方法。微孔板内的细胞经过固定、透化、一抗、二抗孵育、洗涤等步骤后,即可进行微孔板扫描成像,实现对细胞内目标蛋白的精确定量。

In-Cell Western无需进行裂解细胞、制胶、电泳、转膜等步骤,不仅节省了大量时间,而且大大提升了实验通量和重复性。近红外双通道检测,有效降低了背景,可直接对 96 孔板/384 孔板进行高通量检测成像。

02 In-Cell Western实验流程


实验流程步骤

  ①以一定密度在96/384孔板上培养细胞;
  ②生长到合适密度后,加药物或其他处理;
  ③加入多聚甲醛进行固定;
  ④加入Triton X-100对细胞进行透化处理;
  ⑤封闭30 min;
  ⑥加入一抗孵育1h;
  ⑦加入荧光标记二抗孵育1h,洗涤检测。

03 In-Cell Western重复性更高


GAPDH和PMLC20通过Western Blot分别在两张膜上各做13个重复,CV 0.27;GAPDH和PMLC20通过In-Cell Western检测,30个重复,CV 0.08-0.16。

与传统Western Blot相比,In-Cell Western的通量更高,CV更小,提高实验结果重复性和准确性。

与传统Western Blot相比,In-Cell Western 更快速便捷。

04 In-Cell Western的应用

In-Cell Western的应用举例-蛋白磷酸化研究

该实验利用In-Cell Western技术检测ERK蛋白的磷酸化水平。总ERK蛋白(700 nm)作为参照蛋白,进行蛋白均一化。通过不同浓度的EGF(Epidermal Growth Factor,表皮生长因子)刺激细胞,来观察ERK蛋白磷酸化(800 nm)水平变化。

随着EGF的浓度逐渐增加,ERK蛋白磷酸化程度显著增加。加入100 ng/ml 的EGF比不加入EGF的ERK蛋白磷酸化高出16倍以上。

高通量快速的In-Cell Western已广泛应用到细胞自噬、凋亡、癌症、药物研究、信号转导、离子通道、基因表达等多个应用领域。

In-Cell Western应用文献还可登录Licor官网查询:https://www.licor.com/bio/applications/in-cell-western

05 In-Cell Western的优势

优势总结

  ①高通量,一次可实现96/384样品检测;
  ②可用不同荧光标记二抗同时检测两个蛋白;
  ③可做大分子量细胞蛋白检测;
  ④特异性高、灵敏性好,
  ⑤重复性好、精确度好;
  ⑥无需细胞裂解、制胶、电泳以及转膜等步骤,减少误差,提高实验效率,节约时间。

In-Cell Western 技术是由LI-COR公司提出并优化而成的一种实验技术,配合Odyssey CLX 双色近红外成像系统使用,更专业、效果更好。

LI-COR公司的Odyssey® CLX 双色近红外成像系统可以实现定量Western Blot检测,具有重复性好、定量准确、 双色荧光成像、背景低、灵敏度高、可直接检测、应用范围广等多种优势,其不仅可以进行孔板的In-Cell Western检测,还可以实现近红外荧光Western Blot 、组织切片成像、On-Cell Western、EMSA/凝胶迁移实验、荧光蛋白质芯片、荧光核酸芯片、考染胶成像、器官成像等多种应用。

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