Cell:单细胞全基因组甲基化测序揭示乳腺癌转移新机制

【字体: 时间:2020年09月10日 来源:吉凯基因

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  此研究提供了乳腺癌中单个CTC和簇状CTC的全基因组DNA甲基化图景,强调了影响转移的基本差异,并能够鉴定具有簇蛋白靶向的化合物,且具有直接的临床适用性。

  

循环肿瘤细胞(CTC)是那些离开癌性病变并进入血流的细胞。CTC在癌症患者的血液中以单个CTC和CTC簇的形式呈现,后者具有更高的转移能力。循环肿瘤细胞(CTC)形成簇的能力与转移潜能的增加有关。异常的DNA甲基化模式,包括全基因组低甲基化和高甲基化,都与几种人类癌症有关。尽管对原发性肿瘤的DNA甲基化分析已进行了广泛研究,但在转移扩散过程中影响DNA甲基化的因素的研究仍然不多。

研究者结合了从乳腺癌患者和小鼠模型中基于微流体的CTC捕获,单细胞水平的DNA甲基化和RNA表达分析,具有2,486种FDA批准化合物的药物筛选以及在小鼠模型中进行的功能验证研究。此研究提供了乳腺癌中单个CTC和簇状CTC的全基因组DNA甲基化图景,强调了影响转移的基本差异,并能够鉴定具有簇蛋白靶向的化合物,且具有直接的临床适用性。

CTC簇和单个CTC中的甲基化差异区域

研究人员专门研究了单个CTC和CTC簇之间的差异甲基化区域(DMR),以此来评估平均甲基化水平。CTC簇中有1,305个区域被甲基化,而单个CTC中有2,042个被甲基化,异种移植患者也具有类似的结果(图1A和1B)。转录因子结合位点(TFBS)上DNA甲基化的丧失与癌症的进展有关。在特定于单个CTC或CTC簇的低甲基化区域中,我们发现了大量TFBS的显着富集,其中许多TFBS在患者和异种移植衍生的CTC之间重叠(图1C-F)。这些结果说明,CTC簇比CTC甲基化程度更低。

簇相关的低甲基化区域与乳腺癌患者的预后不良有关

在预后较差的部分乳腺癌患者中,与CTC簇相关的低甲基化区域在原发性肿瘤水平上也存在低甲基化,这说明簇相关的低甲基化区域与乳腺癌患者的预后不良有关(图2A和2B)。

与增殖有关的基因在CTC簇中富集

接下来对6名进行性转移性疾病的乳腺癌患者的48个单个CTC和24个CTC簇,3种异种移植模型中的49个单CTC和54个CTC簇进行转录组范围的加权基因共表达网络分析(WGCNA),结果发现CTC簇具有比单个CTC更高的增殖速率,这与我们的DNA甲基化结果相符(图3A-C)。

干细胞相关基因在CTC簇中富集

DNA甲基化分析指出,与增殖和干性相关的TF网络在CTC簇中都有所展示,这暗示着CTC簇与干性相关基因的表达之间存在某种联系。结果发现,与单个CTC相比,CTC簇具有以干细胞和增殖相关的网络为中心的网络,该网络以包括OCT4,SOX2,NANOG和SIN3A在内的关键转录因子的活性为中心。这些程序的激活可能在确定CTC簇的转移能力中起关键作用(图4A-D)。

 

FDA批准的CTC簇靶向剂的鉴定

接下来,我们试图确定CTC簇的脆弱性,并测试在将簇分离为单个细胞后,簇CTC的表观遗传和转录特征是否可逆。为此,我们评估了2486种FDA批准的化合物,从两名乳腺癌患者(BR16和BRx50)获得的人乳腺CTC衍生细胞簇的能力。结果发现包括Na + / K + -ATPase抑制剂家族在内的两类化合物均会导致两种CTC衍生细胞系的平均CTC簇大小显着降低(图5A和5B)。

CTC簇的解离导致关键部位的DNA甲基化重塑

为了评估CTC簇解离成单细胞是否会导致DNA甲基化重塑,我们分别用6种CTC簇解离化合物处理了4种CTC衍生的细胞系。结果表明,Na+/K+ ATPase的抑制通过细胞内Ca2+浓度的增加导致CTC簇解离,进而抑制细胞间连接的形成,从而导致DNA甲基化重塑(图6A-C)。

Na+/K+ -ATPase抑制剂治疗抑制自发转移形成

接下来进行动物实验探究Na+/K+ -ATPase抑制剂哇巴因和洋地黄毒苷是否也能在体内破坏CTC簇。结果表明,体内Na+/K+ ATPase抑制作用抑制了癌灶自发脱落的CTC簇的能力,导致转移接种能力显著降低(图7A-G)。

在这里,通过单细胞层面的DNA甲基化和RNA表达分析,我们描述了来自乳腺癌患者和小鼠模型的单个CTC和CTC簇在全基因组范围内的DNA甲基化态势。我们发现,与干性和增殖相关的转录因子的结合位点在CTC簇中被特异性地低甲基化,包括OCT4、NANOG、SOX2和SIN3A结合位点。在2486种FDA批准的化合物中,我们确定了Na+/K+ ATPase抑制剂,这些抑制剂可将CTC簇分解为单个细胞,从而导致关键部位的DNA甲基化重塑和转移抑制。因此,我们的研究结果将CTC聚类与DNA甲基化的特定变化联系起来,这些变化有助于开发靶向簇的化合物来抑制癌症的扩散。

参考文献:
Gkountela S , Castro-Giner F , Szczerba B M , et al. Circulating Tumor Cell Clustering Shapes DNA Methylation to Enable Metastasis Seeding[J]. Cell, 2019, 176(1-2):98-112.e14.

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