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干货推荐 | 肿瘤突变耐药研究有“捷径”吗?

【字体: 时间:2020年09月17日 来源:吉凯基因

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  很多课题组就收集临床耐药和敏感样品进行WES,寻找耐药和敏感间的突变差异基因。把这些突变差异基因在细胞上进行药敏功能验证。这个路径有不少成功的研究,但也有更多的失败研究。

从肿瘤的发生角度,经典的理论上是说,肿瘤是由突变造成。突变造成驱动基因的激活、抑癌基因的失活。

引申到肿瘤耐药领域,理论上也是认为,突变造成药敏基因的失活、耐药基因的激活。

于是,很多课题组就收集临床耐药和敏感样品进行WES,寻找耐药和敏感间的突变差异基因。把这些突变差异基因在细胞上进行药敏功能验证。

这个路径有不少成功的研究,但也有更多的失败研究。

这个路径中需要解决的问题

1、突变率

我们都知道,肿瘤是异质性很强的。不同病人的相同类型肿瘤,其突变组成肯定是有区别的。在WES数据分析时,就需要考虑突变率。一般建议是,同一个基因突变在两个病人中出现,我们认为是相对可信的。这样子,如果我们做了20例耐药样品,那么其在耐药中出现的比例是10%。肿瘤药物克挫替尼的靶点ROS1融合突变,在肺癌中的突变率为1%左右。

按照这样分析,会出现大量候选基因突变。

2、突变功能验证

  • 如果是CNV,基因不是很大的话,做过表达就OK。
  • 如果是fusion,看看有多大,如果不是很大的话,做过表达也OK。
  • 如果是点突变,那就要看是否在CDS区,是否改变氨基酸组成。如果不在CDS区,这里就比较复杂了。

看上去路径都存在,但WES中出来那么多突变基因,且突变类型也存在多种类型,如何选择基因进行功能验证呢?

再增加一个肿瘤耐药研究中遇到的问题:样品。

很多耐药的样品,要么是石蜡样品,要么是穿刺样品。这种情况下,做RNA-seq或者蛋白组,数据质量不高,往往在这里建议是做WES,WES数据在这类样品类型中比较靠谱。

在肿瘤耐药研究中,我们是否有其他路径呢?

在讨论路径之前,我们看一下肺癌中EGFR通路。KEGG的EGFR TYROSINE KINASE INHIBITOR RESISTANCE通路。

分成这么几个部分,a、膜外因子;b、膜上受体(酪氨酸激酶);c、膜内信号分子(信号级联分子);d、TF转录因子,把信号传递入核;e、TF靶基因,转录表达出来发挥功能效应。

我们看中间与MAPK通路相关的部分。膜外因子结合EGFR,EGFR通过Shc/Grb2/Sos激活Ras,Ras再激活Raf,Raf为激酶,其磷酸化激活MEK,MEK磷酸化激活ERK,ERK磷酸化下游TF,TF入核后转录下游效应基因,促进增殖转移等。

EGFR突变是NSCLC中最常见的突变。中国肺腺癌患者EGFR突变率可高达50%左右。FDA和CFDA已经批准吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、奥希替尼等用于EGFR突变的NSCLC患者。

EGFR突变属于促进肿瘤发生发展的驱动基因突变(driver mutation,driver gene)。

这些药物在临床使用前,会进行K-Ras突变检测。为啥呢?因为,K-Ras突变是激活突变,其突变后,不需要上游EGFR来源的信号就可以激活下游,促进增殖和存活,因此其突变是吉非替尼等靶向药耐药的原因。K-Ras在肺腺癌中的突变率为15%-25%。

我们从KEGG图上看到,BRAF在K-Ras下游,其突变也是激活突变,因此也是耐药突变。BRAF在白种人NSCLC中突变率为1%-3%,亚裔人群中比较低。因此肺癌中大家常听到的是K-Ras检测。

有了以上背景,跟大家探讨一个肿瘤耐药突变基因的研究路径。供大家参考。

一、临床样品组学

1、全外显子组测序(WES)

耐药和敏感组(主要看PR和PD组),如果是石蜡样品,或者穿刺样品,WES是靠谱的。分析两者间存在哪些突变基因。

这里,建议是把相应病人的正常组织基因组也做个WES(可以用白细胞),从肿瘤组织的WES数据中,把相应病人正常组织WES中的variation(主要是SNP)扣除掉,数据更精准。

一般建议,两例及以上病人中都出现的突变基因优先入选。2/20为10%,如果您想找5%的突变,那就需要做到40例,2/40。(后续研究中,根据数据情况看,是把入选条件放松,还是收紧。)

2、转录组及其他

如果有新鲜样品,且有两粒黄豆那么大,那么建议,同一个病人的样品,一份做WES,一份做RNA-seq。如果有更多的,做TMT+TMT磷酸化蛋白组。

PS:
这里是否做WGS?需要看课题组研究突变的技术储备。如果您课题组能够分析Hi-C数据且往后做功能,那么就建议做WGS。

二、细胞样品组学

1、细胞药敏

把临床用药在细胞上进行药敏实验。选择合适的药物浓度进入下游。

这里,因为细胞间也存在差异,如果经费允许,建议两株及以上细胞进入下游步骤。(至于不同细胞株的数据,是取交集还是并集进入生信分析,都可以。看具体数据进行调整。)

2、转录组

加药和不加药样品进行RNA-seq转录组测序,寻找加药后表达发生改变的基因。

比如,加药后增高的基因,那么很可能这类增高的基因是导致肿瘤细胞凋亡的原因(药理基因)。如果在前面WES数据中,这类基因出现突变,那么很可能是突变失活,导致耐药。

通过细胞上转录组的数据,缩小临床样品上的候选基因范围。

通过细胞转录组与临床样品WES跨组学分析,能够找到K-Ras、BRAF这样的突变基因吗。答案是不能。细胞转录组与临床样品WES跨组学分析找到的是,在药敏中有表达量改变的基因。也就是前面TF下游的靶基因。而K-Ras、BRAF这类基因,是出现了活性改变,这个案例中是磷酸化激活。这类基因怎么找。看下面。

3、TMT+TMT磷酸化蛋白组

加药和不加药样品进行TMT+TMT磷酸化蛋白组,寻找加药后磷酸化发生改变的蛋白(基因)。

K-Ras和BRAF在加药后看到磷酸化降低,在临床样品WES中看到有突变。就可以考虑突变激活。

为啥要同时做TMT和TMT磷酸化呢?因为TMT磷酸化蛋白组中看到的磷酸化改变,有可能是总蛋白改变造成磷酸化量的改变,因此用TMT的数据来修正磷酸化的数据。这样磷酸化改变数据更精准。

4、其他组学

细胞内传递信号的主要方式是磷酸化,因此这里加上了磷酸化改变的组学检测。如果您对其他信号传递方式感兴趣,这里可以加上组学筛选。把组学差异,与临床样品WES数据进行跨组学分析。

最近比较火的m6A可以加进来吗?答案是可以。

三、细胞功能验证

1、基因药敏验证

根据基因在细胞加药时的表现,选择合适的基因操作工具进行基因功能验证。以验证其与药敏的关系。
比如,加药后增高的基因,在临床WES中有突变。那么入选来做功能。

有两种做法

a、单纯基因功能

对于加药后增高的基因,在细胞中进行过表达,看细胞存活情况。
对于加药后降低的基因,就干扰。

b、加药回复实验

对于加药后增高的基因,在细胞中加药的同时,进行干扰,看细胞存活情况是否改善。功能回复实验。
对于加药后降低的基因,在细胞中加药的同时,进行过表达。

需要提醒的是,功能回复实验,文章中出现这个数据的,都是成功的。需要注意成功率。所以,一般建议先做单纯基因功能。

2、突变功能

基因药敏验证中,做了过表达的,把突变体进行过表达,与野生型进行对比,从而判断突变是否与功能相关。

基因药敏验证中,做了干扰的,在干扰的同时把野生型和突变体进行过表达,看回复效应,从而判断突变是否参与功能。

最后的建议,是写文章的建议:

如果上述研究一切顺利,那么您想怎么写,都可以。如果做的是磷酸化修饰这类修饰调控的机制,找十分以上合适的杂志投稿。

如果上述研究,在突变功能这里遇到困难,那么写文章时,以细胞和动物的药敏或药理思路为主,最后说,我们找到的药理或药敏基因在临床耐药样品上存在一定的突变比例。用这个思路来写文章。如果机制上也是磷酸化修饰这类修饰调控的机制,那么也是一样到十分以上杂志中选择合适的杂志投稿。



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