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初学者的福利!浅谈RNA干扰研究解决方案

【字体: 时间:2021年02月05日 来源:Takara

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  由于基于RNAi的工具和技术的激增,以及RNAi在需要瞬时基因敲除的特殊应用中的独特优势,RNAi仍然是现代生物学家的一个重要研究工具。

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种利用小RNA发夹结构来抑制基因表达的有效方法,在生物医学研究中取得了重大进展,特别是在通过干扰基因功能来解析基因型-表型关系方面。由于基于RNAi的工具和技术的激增,以及RNAi在需要瞬时基因敲除的特殊应用中的独特优势,RNAi仍然是现代生物学家的一个重要研究工具。

尽管CRISPR/Cas9介导的基因编辑等新技术的发展,可能会使RNAi在特定应用中的效用黯然失色,但这项重要的技术仍然被广泛使用,具有高度的适用性。RNAi是一种双链RNA介导的机制,在转录后水平调控基因表达,其工作原理是将双链RNA发夹结构加工成小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)或微RNA (microRNA/miRNA)。然后,这些小RNA与同源的mRNA结合,并通过RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC)诱导其降解。

miRNA的形成和调控机制

MicroRNA(miRNA)是一类长度为19-23nt的小型非编码RNA,对植物和动物的基因表达具有调节作用,最先在秀丽隐杆线虫中被发现,随后被证明在人类等高等脊椎动物的基因组中编码,以序列特异性方式作用于靶mRNA,以促进其切割、降解或降低其翻译效率。

miRNA的初级产物是pri-miRNA,它是一种至少包含一个发夹结构的长RNA转录本,在细胞核内核糖核酸酶RNase III(即Drosha和DGCR8/Pasha)的作用下,生成前体miRNA(pre-miRNA)。随后,pre-miRNA在Exportin-5复合物的作用下被转运出细胞核,在细胞质中由Dicer酶剪切成为成熟的miRNA。成熟的miRNAs可通过Argonaute蛋白质家族与RISC结合,从而导致靶mRNA降解或翻译抑制(图1描述了miRNA的形成和调控机制)。

siRNA的形成和调控机制

Small interfering RNA(siRNA)是一种小的外源性dsRNA,包含约20个核苷酸,在体外RNA干扰(RNAi)过程中人工合成或通过转运体从细胞核转移到细胞质中。在秀丽隐杆线虫中,dsRNA通过跨膜蛋白SID-1被转移到细胞质中,再经DCR-1处理形成双链siRNA。这些双链siRNA与RISC结合形成小干扰RISC(small interfering RISC, siRISC),然后通过解旋酶作用激活siRISC。随后,激活的siRISC以序列特异性的方式作用于靶mRNA,导致互补靶mRNA降解,从而抑制翻译过程(图1描述了siRNA的形成和调控机制)。

miRNA和siRNA之间既有相似之处,比如长度均约为20个核苷酸,都由dsRNA产生,由Dicer酶切割参与RNAi过程。但二者也有许多不同之处,比如miRNA是单链小RNA,通过抑制翻译而不是影响转录稳定性来调节基因表达,而siRNA是双链小RNA,通过在转录后水平上降解靶mRNA来调节基因表达等。面对miRNA和siRNA研究的巨大挑战,Takara可为您提供多种研究方案,涵盖small RNA的提取、克隆、定量、表达、siRNA合成、体外转录等相关产品,下面就让我们一睹为快吧!

miRNA研究解决方案

Small RNA 提取

产品特点:

1. 广谱性强。可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取Small RNA,包括tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、microRNA (miRNA) 和 siRNA。
2. 纯度佳。提取的Small RNA纯度高,基本可以除去28S和18S大片段RNA、蛋白质及基因组DNA。提取的Small RNA适用于Northern blot analysis、Quantitative、Real Time RT-PCR、Microarray analysis等分子生物学实验。
3. 快速简便。实验操作快速方便,整个操作在一小时内便可完成。
4. 颜色鲜明。加入氯仿离心后,会形成无色的上清层和鲜红色的下层 (有机层)。

Small RNA 克隆

产品特点:

1. 该系列载体是一类简单的应用于哺乳动物细胞的基因表达载体,具有单纯疱疹病毒胸苷激酶来源的polyA信号。
2. 抗性筛选标记是新霉素或嘌呤霉素。
3. 可用于前体microRNA的转录。

microRNA 定量PCR

产品特点:

1. 通用的加A尾反转录原理,一次反转样品中的不同microRNA
2. 简单的一步法cDNA合成系统,无需复杂的操作
3. 可使用同一RNA模板进行不同microRNA的定量检测,节省样品用量
4. 试剂盒附带通用的PCR下游引物,只需设计特异性的上游引物即可
5. 可对低至50 copies的microRNA进行检测,灵敏度高
6. 产品有独立的反转录试剂盒和反转定量二合一的试剂盒可供选择,灵活性高

实验原理:

Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green® Kit的原理是在单管中一步法合成第一链cDNA,然后使用miRNA特异性引物和TB Green试剂对cDNA进行特异性的定量扩增。在Mir-X cDNA合成反应中,使用poly(A)聚合酶将RNA加A尾,然后使用修饰的oligo(dT)引物和SMART MMLV Reverse Transcriptase进行反转录反应。

microRNA 表达

产品特点:

Tet可诱导性哺乳动物表达载体,可产生microRNA与荧光蛋白质(绿色荧光ZsGreen1/红色荧光mCherry)共表达。

siRNA研究解决方案

siRNA 化学合成

siRNA(约20个碱基左右)的合成

注:
① 冻结干燥品。 另附送1 ml 5 × Annealing Buffer和1 ml DEPC处理水。
5 × Annealing Buffer组成:
500 mM CH3COOK,150 mM HEPES-KOH (pH7.4),10 mM (CH3COO)2Mg
② Annealing后的制品冻结溶液 (20 pmol/μl),可直接用于转染。
溶液组成:100 mM CH3COOK,30 mM HEPES-KOH (pH7.4) ,2 mM (CH3COO)2Mg

siRNA 体外转录

产品特点:

1. 包含实验必备的关键酶(T7 RNA Polymerase、RNase T1)、Buffer、NTP、对照模板以及RNase Inhibitor。
2. 以试剂盒提供的20 ng Control Template为模板,可在20 μl体系中反转录合成约10 μg的2 kb单链RNA。
3. 操作灵活,步骤简单,试剂盒中包含RNase T1,可特异性切断单链RNA的鸟苷酸3'端磷酸,特别适合自制多个siRNA用于筛选性RNAi实验。

合成的siRNA定量

产品特点:

1. 对合成的siRNA进行高灵敏度的定量。
2. 适用于3’末端带有脱氧胸腺嘧啶d(TT)的siRNA的定量。

【实验例】

方法:
在50 μl小鼠全血(柠檬酸钠抗凝剂)中分别添加10 amol、1 fmol、100 fmol的Control siRNA后,使用RNAiso Plus(Code No.: 9108)及Dr. GenTLE Precipitation Carrier(Code No.: 9094)制备Total RNA(50 μl)。
使用本制品和TB Green Premix Ex Taq II (Perfect Real Time) 进行Real Time PCR反应,对Control siRNA进行定量检测。

结果:
使用本制品,通过Real Time PCR解析方法,对于添加到小鼠血液中的siRNA进行了定量。


图5  小鼠血液样品中掺入的Control siRNA定量结果

siRNA/ssRNA Marker

shRNA 表达

RNAi实验的主要技术有合成的siRNA直接导入细胞的方法和表达载体在细胞内表达siRNA的方法,这两种方法应用比较普遍。合成的siRNA直接导入细胞的方法RNAi效果短暂;用表达载体在细胞内表达siRNA的方法,能够获得持续性的RNAi效果,一旦获得了导入表达载体的细胞,就有可能获得基因表达长期受抑制的效果。 因为逆转录病毒载体可以在感染细胞的染色体上稳定的重组目的基因,所以使用载体转染方法获得长期稳定的RNA干扰作用是非常有效的。pSINsi载体系列是以自我复制缺陷型逆转录病毒载体作为基本骨架,使用RNA polymerase III (pol III)系列的promoter表达hairpin型RNA。RNA polymerase III (pol III)系列promoter下游的克隆位点插入表达hairpin型RNA的合成寡核苷酸DNA,就可以获得siRNA表达逆转录病毒载体,以新霉素作为这种载体的抗性筛选基因。

pBAsi vector series是利用RNA polymerase III (pol III) 系列的promoter表达siRNA的质粒载体。该质粒搭载了新霉素抗性基因及嘌呤霉素抗性基因。可用于导入细胞的筛选。通过在pol III系列的promoter的下游插入表达hairpin型RNA的合成DNA序列可制备siRNA 表达质粒。将得到的质粒转入细胞中,即可用于RNAi实验。

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