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怎样轻松快速地完成分子克隆?一文读懂秒变高手

【字体: 时间:2021年03月11日 来源:生物通

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  基于同源序列的无缝组装克隆技术,能够实现在任意载体的任意位置无缝(无痕)插入任意长度的目标片段——任意大小、任意GC含量、甚至内部重复序列结构、或者多个片段的正向无缝克隆,启动子后SD序列与ATG的距离也可以自行控制而不再是问题。

    虽然伟大的、人手必备的“分子生物学宝典”——《分子克隆》——里涵盖了分子生物学领域几乎各种基础技术(新中文版三册足足3.5公斤,知识就这么沉重),但实际咱们平时说的分子克隆技术主要是指将含有“目的基因的DNA片段”以“体外重组技术”插入某种DNA载体上,得到一个重组DNA分子。分子克隆技术现在早已算不上是“超酷”的前沿技术,只能算分子生物学基础入门技术,但它依然是整个分子生物学基础的核心之一,熟练掌握分子克隆技术之关键、又快又准地完成分子克隆依然是实验必需的看家本领。

经典分子克隆技术vs无缝组装克隆技术
    技术总是随着时间向前发展的,由难到易,化繁为简,将不能变为可能。分子克隆技术的发展完美体现了这一点。

    以构建表达载体为例,经典分子克隆中,要将目标片段插入载体,全靠内切酶的拆分和连接酶的拼接。关键是选择合适的酶切位点,使得酶切“拆”得的目标片段末端和相应载体末端正好能互补“拼”在一起,连接酶才能连起来。选择酶时首先不能破坏目标基因完整性(包含从起始密码到终止密码)及载体完整性;其次,尽量避免选两个酶切生成粘端一样的(粘端互补)——两边粘端一样的载体“偏爱”自我连接、目标片段正向/反向插入傻傻分不清,徒增后面的筛选烦恼。做实验,有时真需要一点运气。

    好运气不常有,合适的酶切位点跟合适的爱情一样不那么容易碰到。载体和片段的酶切位点难得一致——有时你有我无,有时前后顺序相反,有时两边全都对不上。但是“拼接”双方的任务是必须完成滴,运气不够就要靠技术和经验:有没有同裂酶?有没有能产生同样粘端可互补的酶——举例说BamH I(G/GATCC)、Bcl I(T/GATCA)、Bgl II(A/GATCT)、Dpn II(/GATC)、BstYI(R/GATCY)这几个酶切产物粘端突出部分都一样是5’GATC,能互补,可以相互连接。此外,所有平末端酶切产物都可以相互拼接,只是连接效率低些。要是运气再背点、酶切粘端怎么都不配对?用Klenow大片段或者T4聚合酶或“削平”或“补齐”得到平末端,再“强行连接”。。。这种目标片段前后都是平端的、或者单酶切的,载体“自恋”(自我连接)还可以用大小区分,目标片段可能正向接入或者倒装,如何在筛选时进行区分,又多了一个麻烦事儿。要是用到甲基化敏感的内切酶,比如HPhI(对Dam、Dcm甲基化敏感),需要用有特定甲基化背景(dam-/dcm-)菌株扩增得到的质粒才能切割,等等,(此处省略克隆秘笈若干)。

        
酶界之“求同存异,合作共赢”                只要“切削补”,都能凑一起

    终于盘算好能让目标片段和载体牵手了,你还得要检查一下这一轮操作插入载体后,在目标基因ATG前面会不会意外引入终止密码、或者不同编码框的ATG——提前终止或者密码“三观不一致”都可能影响后续的表达。筛选时需要有可靠的方法来验证目标片段大小是否正确、“正向插入”还是“反向插入”。有时还需要考虑ATG距离启动子后SD序列的距离是否合适,如果不合适可能会影响表达效率。。。“酶切复酶切,电泳加连接”,讲真,这一圈下来有时挺让人崩溃的。

    技术的发展不断向前。受同源重组启发而出现的重组酶和TOPO克隆技术,能快速实现目标基因到载体、以及不同表达载体之间切换构建,但需要分别在载体和目标基因两端各引入一段特定酶识别序列,以实现同源重组,而这额外十多个碱基的特定序列始终保留在克隆产物上消不掉——目标片段后面多一点不要紧,目标片段前面这一截(通常在启动子后/ATG前面)真是如鲠在喉——要是这段序列正好是载体两端的序列就好了。。。

    无缝克隆技术应运而生——通过引物在目标片段两端添加一小段跟载体两端同源的序列,扩增得到的目标片段和线性化载体对应的末端同源,用特定外切核酸酶消化末端数个碱基得到粘末端,就能互补结合——全程不会加入额外的碱基!

    几家克隆技术领先的公司先后推出了基于同源序列的无缝组装克隆技术,能够实现在任意载体任意位置无缝(无痕)插入任意长度的目标片段——任意大小、任意GC含量、甚至内部重复序列结构,多个片段按顺序连接,统统都能实现精确的正向无缝克隆——没有插入方向的困扰,没有找酶切位点对眼神的繁琐,基本能避免载体自连接,启动子后SD序列与ATG的距离也可以自行控制而不再是问题。简直完美。经过不断优化,如今一次过将多达15-20个片段按顺序排列、一次性克隆到载体上,甚至单个片段100kb连续组装合成,都成为可行。那些曾经的克隆之困,比如特别大的片段克隆、构建共表达载体、同一载体表达多个亚基/蛋白或者调控元件、或者需在克隆外源基因的同时给它加上标签或者信号肽修饰或者融合基因什么的,都不再成为难题,一切变得可行了,并且操作简单,方便快捷。回望对比一下传统克隆的兜兜转转、如琢如磨,无缝组装克隆技术的进步实在令人赞叹!

无缝组装克隆之Step 123——带你飞,把还在用传统方法“琢磨”的他甩在后面
    基于同源序列的无缝组装克隆技术,关键是利用PCR引物,在目标片段两端引入与线性化载体两端同源的一段序列。基本策略是
1. 选定插入外源片段的位置,以此线性化载体
2.设计包含线性化载体两端序列和目标片段两端序列的引物,扩增目标片段
3.扩增片段与线性化载体、组装预混酶混合反应
4.转化感受态细胞
   
Step1 如果载体上正好有合适插入目标片段的酶切位点,酶切载体使之线性化。为了降低单酶切载体不完全的几率,减少载体自连和提高筛选成功率,强烈建议双酶切——后面一个切点只要距离第一个切点5个碱基以上就行(主要是给两个酶留出结合空间)。如果没有合适的酶切位点,根据选定插入位点设计引物,用反向PCR来获得线性化载体。在多片段组装克隆的世界里,凡是酶切搞不定的,统统PCR引物设计搞定。简单粗暴有效。
   
Step2 根据线性化载体两端的序列,设计目标片段的引物——划重点!这对引物外侧要有15-40碱基与载体两端分别同源,内侧要有15-20个碱基与目标片段同源。如果想要设计启动子SD序列跟ATG的距离,这就是好机会。合成引物不要超过65个碱基为好。

Step3 以这对引物PCR目标基因,就能得到两端与载体同源的目标片段。按比例混合片段和线性化载体,加入关键试剂——预混酶并在50度保温15-60分钟(因插入片段数量而略有不同,以操作手册为准)——以赛默飞的GeneArt™ Gibson Assembly® 克隆试剂盒系列为例,Gibson Assembly实际上是生命科学狂人文特尔(就是那个敢单挑6国合力的国际人类基因组计划还占尽上风,逼得当时美国总统出面协调让双方合作并同时发表结果的)东山再起后成立的Venter研究所旗下Gibson博士开发的,里面包含了精心优化搭配的三种酶活性:外切酶会外切双链末端而产生单链3’突出端,使得外源片段和线性化载体的互补末端能够退火,聚合酶活性会填补退火片段产生的缺口,连接酶活性能够在重组后进行连接。得到的产物是闭合载体,可以直接进入Step4转化感受态细胞或者RCA了。还有的产品甚至连后面的聚合酶和连接酶都不需要,克隆效率一样高还能避免填补缺口时的意外错配,强的。

    因为整个过程不会引入额外的碱基,可在预定位置精准插入外源片段,因此亦有无缝克隆,无痕克隆的美誉。这个方法还可以实现一步完成多个片段连续组装,只要设计PCR引物让相邻片段之间具有15-30个碱基的同源序列重叠,就可以实现单管一步反应,完成组装,而且还成功率高,保真度高,能大大减少重复筛选验证的工作量。

    多片段连续组装如此简单易行,有越来越多应用之处——不单用于一般的多亚基/多调控元件/多蛋白表达载体构建、或者融合基因,还可以用于合成超大片段基因且成本低廉;甚至基因的多位点定点突变甚至改造DNA也能大显身手——只要在目标基因内分区并在设计PCR引物时引入突变位点或者改造序列就可以实现。

    当然,不同的需求和应用:2-3个片段组装和15个片段组装、1-2kb和100kb片段组装,实际操作起来优化条件肯定不能完全一样,甚至超长片段适用的转化菌株也跟普通菌株不一样(比如GeneArt EX超长版就建议用DH10B电转感受态细胞)。市面上有多种为满足不同需求而优化条件的商品化组装克隆试剂盒,可以根据自己的需求选出最合适自己需要的——选对合适的Kit,每天都是好心情,实验高歌猛进充满成就感;选不合适就只能天天re-search了——反反复复来来回回(re-)地摸索(search)尝试,挺折磨的。选择kit时一般留意几个参数:插入片段长度,单次反应可插入片段数量,同源序列长度——即合成引物时要求添加的载体同源序列长度,反应时间,当然还有克隆效率(几个领先品牌的产品说明都显示单片段插克隆效率>95%——片段越多效率会下降的)。。。。。市售产品中,是否包含感受态细胞,是否包含质粒纯化试剂或者PCR纯化试剂,都会影响产品单价。

GA 系

IF系

N系

允许插入片段长度/单次可插入片段数

EX:100bp-100kb, 1-15片段HF:500bp-32kb1-6片段

Up to 15kb,1-Multiple

NB:>15kb,1-11片段
NGi: >15kb,1-6片段

引物要求添加的
同源序列长度

EX:20-40bp
HF:20-40bp

15bp

15-30bp

反应时间

EX:80min,单管两步
HF:15min-60min,单管一步

15min, 单管一步

15min-60min

补充说明

EX:加长版
HF:高保真

不用连接酶!

另有GG系可以一次组装多达24个片段

 

    后继的筛选验证工作同经典方法一样——抗性筛选,挑克隆扩增纯化,电泳+酶切或者PCR验证,最后挑几个最有可能的克隆去测序验证。如今分子克隆中的PCR一般都会选择高保真酶——出错率比Taq低得多、扩增长片段效果更好,要是几十kb还得是EX加长版高保真酶——相比后继测序验证的费用,这钱万万省不得的。

    总而言之,基于同源序列的无缝组装克隆技术,相比经典分子克隆技术可谓飞跃提升,更为强大,更容易操作,适用性与设计灵活性更强,是值得深入了解的入门必备基础实验技能。回顾分子克隆技术的发展,亦可以体会到开放性思维如何从已知中推进技术发展,技术进步对我们日常实验、乃至对生命科学的认知会产生怎样翻天覆地的影响。

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