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In-Fusion无缝克隆,远没有你想的那么普通!

【字体: 时间:2021年03月26日 来源:生物通

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  无缝克隆是一种显著区别于传统酶切连接方法的新技术,可在任意载体的任意位置进行单片段或多片段的定向克隆,化繁杂的酶切连接操作为一步简单的无缝克隆反应,大大提高工作效率。

无缝克隆是一种显著区别于传统酶切连接方法的新技术,可在任意载体的任意位置进行单片段或多片段的定向克隆,化繁杂的酶切连接操作为一步简单的无缝克隆反应,大大提高工作效率。

关于无缝克隆的原理,我们经常接触的是这样言简意赅的解释:
基于插入片段和线性化载体末端15-20 bp的同源序列进行同源重组从而实现克隆的方法。

这解释虽然简单,但难免有些“玄学”,所以我们把它配上图再“揉碎”了来讲,应该是这样的:

现在是不是对无缝克隆有了更清晰的理解?是不是还有点相见恨晚的感觉?觉得有了无缝克隆就可以放肆地连接大载体和大片段?一个片段不够就多连几个?想建库就建库?所有在酶切连接过程中吃过的苦、受过的伤,无缝克隆全都帮你扛?

然而——并没有!

纵观市面上琳琅满目的无缝克隆方法,虽然都是基于以上大的原理框架,但究其设计细节却不尽相同,针对不同实验应用的使用效果也不一样,所谓原理看似挺简单,实际优化不一般!

那应该选哪一个呢?来看一下入坑不后悔,使用没烦恼的In-Fusion无缝克隆吧!

In-Fusion无缝克隆的与众不同

单酶方案
3’-5’外切酶活性 → 可顺利连接末端带A的PCR产物,不影响连接效率
无连接酶 →大幅度降低了背景的影响
无聚合酶 →大概率减少了错配的发生

In-Fusion无缝克隆采用单一酶而非混合酶的方案,依靠感受态细胞自身的酶系统将缺口修复,实现有校正功能的连接。尽管使用了单一酶方案,却还能实现高效稳定的无缝克隆,所以我们才说In-Fusion的酶与众不同,其反应体系优化方法先进、“功力”深厚!

充分优化的实验体系,无论单片段还是多片段克隆,统统只要15 min,正确率>95%
一盒多用,既能做无缝克隆,也可行定点诱变。
畅销十余年积累了宝贵的经验,性能品质经得起时间的考验!

 

据不完全统计使用In-Fusion无缝克隆发表文章所涉及的研究内容, 更多研究内容及发表文章请点击>>

  • COVID-19
    CRISPR/Cas9载体克隆
    抗体工程流程中的高通量克隆
    慢病毒质粒克隆
    合成DNA组装
    人类疾病机制的研究
    不同物种的胚胎发生和发展
    研究各种微生物中的基因调控,蛋白质相互作用和代谢途径,以及哺乳动物细胞的病毒感染
    研究植物的基因调控,生长机制,病毒感染和植物的应激反应 

In-Fusion技术高效、稳定的性能在实际应用中为科研和生产提供新思路,探索新方法。

【实验方法】
使用In-Fusion无缝克隆将抗体可变区(V)cDNA插入片段克隆到其恒定区(C)线性化载体中。转化后,每个转化产物取50 μl加入到含1 ml TB的96-well深孔板中摇动培养过夜。对培养物进行质粒提取,并进行DNA测序以确认所需插入片段的存在。


 

在实验过程中研发人员注意到,In-Fusion方法所具备的很高的克隆效率和“很少甚至没有背景”的特点,使他们能够完全省略转化后的涂板步骤,直接培养转化物得到半克隆库。因为通常情况下,筛选单个重组克隆是克隆实验中最耗时的部分,而In-Fusion技术使他们相信他们正在进行正确的克隆,这样就可以避免工作流程中的一大瓶颈。凭借In-Fusion Cloning的高正确度,他们开发了属于自己的抗体快速生产高通量流程,并通过另一种培养方法进一步简化了操作步骤(Spidel, J.L. et al. 2016)

【客户感言】
“使用In-Fusion的阳性克隆率始终高于我们使用传统的酶切连接法,这使我们能够通过省略转化后涂板的步骤来简化我们的工艺流程并提高产量。由于大多数质粒都含有插入片段,我们可以将转化的细菌培养成库并直接进行小量制备。”——Jared L. Spidel,Morphotek,Inc.

*以上内容为Jared Spidel提供,仅代表个人观点,不代表Morphotek, Inc.或Eisai Inc.。Takara Bio并没有因以上内容为Jared Spidel支付报酬。

In-Fusion无缝克隆的目标不仅仅是简单的连接,更是拓展无限的可能!

In-Fusion升级后性能得到显著提升

In-Fusion Snap Assembly和In-Fusion HD性能比较。分别使用In-Fusion Snap Assembly和In-Fusion HD将五个不同的插入片段(大小从405 bp到1,005 bp不等)同时克隆到一个经反向PCR线性化的2.7 kb的载体中,每组克隆反应重复三次。两个反应系统除了酶预混液不同之外,扩增引物和其他试剂全部相同。转化涂菌后显示Snap Assembly组长出的菌落数是HD组的4倍,挑取10个转化菌落,进一步使用Sanger测序法进行验证,结果显示二者正确率均超过90%。

别怕好物价格高,适逢春促刚刚好!

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【参考文献】
Spidel, Jared L., et al. Rapid high-throughput cloning and stable expression of antibodies in HEK293 cells. Journal of Immunological Methods 439 (2016).

    

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