对金假丝酵母的全基因组分析揭示了多重耐药的新机制

金假丝酵母菌是最近发现的一种人类真菌病原体，对临床上最常用的各类抗真菌药物表现出惊人的多重和泛耐药性。目前，金黄色葡萄球菌已被全球公认为医院内高度关注的病原体，由于。。。

　　

                           

摘要

耳念珠菌因其广泛的多药耐药(MDR)而被全球公认为一种高度关注的机会性真菌病原体。尽管如此，MDR的分子机制在很大程度上仍未被探索。这是通过一系列的体外暴露于唑类、多烯类和棘白菌素而获得的auris中MDR的全基因组进化的首次报道。我们显示了复制数变异的逐步积累和新的突变基因在已知和未知的抗真菌药物耐药性。棘白菌素抗性伴随着FKS1热点1的密码子缺失和FKS1“新”热点3的替换。ERG3和CIS2的突变进一步增加了棘白菌素的MIC。唑类药物易感性下降与转录因子TAC1b突变、药物流出泵Cdr1、含有ERG11的1号染色体片段重复和含有TAC1b的5号染色体完整重复有关。后者与ERG11、TAC1b和CDR2的表达增加有关，但与CDR1无关。ERG3和ERG11同时出现无义突变被证明降低了两性霉素B的敏感性，并伴随氟康唑交叉耐药。MEC3基因的突变进一步增加了多烯MIC，该基因主要在DNA损伤稳态中发挥作用。总之，本研究显示了耐多药菌在金葡菌(C. auris)中发展的惊人潜力和多样性，即使是在一个迄今尚未与耐多药菌相关的分支(clade II)中，也强调了其临床重要性和未来研究的迫切需要。

重要的耳念珠菌是一种最近发现的人类真菌病原体，并显示了一个惊人的潜力，发展对所有类别的抗真菌药物最常用的临床。目前，金耳梭菌已被全球公认为一种高度关注的医院病原。迄今为止，这是第一个在体外监测金葡菌多药耐药(MDR)逐步进展的研究。在已知的耐药基因和以前与耐药无关或模糊相关的基因中，多重新突变揭示了金黄色葡萄球菌分支II分离株的MDR快速进化。此外，本研究表明体外实验进化可以成为发现新的耐药机制的有力工具，尽管它有其局限性。

介绍

在过去的十年发现(1)以来,假丝酵母耳出现了至少39个国家在每一个有人居住的大陆(2),偶尔导致卫生保健相关的爆发致命的念珠菌病(3)。c .耳是大大不同于任何其他念珠菌属物种研究到目前为止,因为它像一个真正的耐多药(MDR)院内病原体(参见耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)(3),这是说明了美国疾病控制和预防中心(CDC) 2019年上市时c .耳真菌作为第一个紧急抗菌素耐药性的威胁(4)之一。c .耳可以为每个药物产生耐药性和每个组合三种主要抗真菌药物的药物类、唑类的(如氟康唑),echinocandins(例如,caspofungin)和多基因(如两性霉素B)。

各种临床分离菌株筛选报告显示，超过80%的分离菌株对氟康唑耐药(5-9)，高达30%的分离菌株对两性霉素B耐药(6,7)。棘白菌素耐药较少，在一些筛选中发现2 - 10%(6,8,10)，但它正在令人担忧地上升(11,12)。总体而言,约90%的c .耳隔离估计获得至少一个耐药性,而30 - 41%是两种药物耐药,和大约4%是广泛耐药(抗三大抗真菌药物类)(4、7)。这些数据显示了前所未有的潜力获得耐多药,不像其他致病性念珠菌属物种(3、12、13)。对于金黄色葡萄球菌耐药的分子机制，特别是对两性霉素B耐药和MDR耐药的分子机制尚不清楚。数以百计的耐药金黄色葡萄球菌菌株已经被测序，它们对唑类和棘白菌素药物敏感性的降低与一些已知的与耐药有关的基因突变有关。尽管如此，一些菌株的高水平耐药和广泛的耐多药不能通过迄今所描述的有限数量的耐药相关突变来解释(3,7)。

唑类耐药与三个单核苷酸多态性(SNPs)(7 - 9,14)和ERG11拷贝数的增加(9,15)有关，ERG11基因编码氟康唑靶lanosterol 14-α-去甲基化酶。ATP结合盒(ABC)转运体Cdr1被证明是auris中唑类物质的外排泵(16 - 18)，另一项研究表明TAC1b的功能获得(GOF)突变可能是这种作用模式的基础(16)。最近的一项研究表明，唑类耐药可能是V染色体重复的结果，V染色体包含几个与耐药和麦角甾醇生物合成有关的基因(19)。此前，耳棘白菌对棘白菌素敏感性的降低仅与SNPs取代氨基酸S639(9,12,20)和F635(21)以及Fks1中F635(22)的缺失有关，Fks1是棘白菌素的靶点，β(1,3) d-葡聚糖合酶。多烯两性霉素B是通过隔离麦角甾醇和诱导氧化应激而起作用的(23)，而不是抑制特定的酶，因此，两性霉素B耐药通常是auris和念珠菌中了解最少的耐药机制之一(12,23)。到目前为止，只有参与麦角甾醇生物合成的基因(即ERG1, ERG2, ERG6和ERG16)(15)和ERG2中的SNPs (24)， FLO8和一个未命名的膜转运编码基因(25)与auris中两性霉素B抗性有关(12,20)。

总的来说，很少有研究能够验证所提出的auris耐药机制(16,18,26,27)，可能是因为缺乏优化的基因编辑系统。在这里，我们应用了一种基于串行转移的实验进化策略，能够追溯单个突变或复制数变化在整个进化过程中的出现，并验证累积效应。通过设计等位基因特异性PCR引物，可以很容易地通过PCR在每天进化的种群中的多个单个克隆上筛选特定突变的存在或缺失。这样，我们在8个基因中追踪到10个非同义突变的出现，它们在5个独立的进化谱系中进化。在本研究中，我们调查了一个II支C. auris菌株的MDR进化，与其他支相比，该支尚处于研究阶段(28)，并被认为不太容易发生耐药性发展(28,29)。以前,五个不同的演化支(演化支我到V,即南亚、东亚、非洲、南美,和伊朗演化支,分别)的c .耳,每个系统由成千上万的单核苷酸多态性(7、30)和常与clade-specific毒性和/或耐药倾向(9日28、29)。本研究表明，clade II auris能够在体外快速获得MDR，其耐药机制为研究clade II auris如何获得耐药提供了新的基础认识。最后，我们的研究提出了利用体外实验进化来发现(多)耐药分子机制的力量和挑战。