新冠病毒RNA可插入人类染色体DNA？新证据引发对mRNA疫苗安全性担忧

新的实验结果提示逆转录的SARS-CoV-2 RNA可以整合到培养的人类细胞的基因组中，并可以在患者来源的组织中表达。这项研究5月6日发表在《PNAS》上，一些科学家们评论，病毒RNA逆转录事件对mRNA疫苗的安全性提出了挑战。

　　

     

          

实验室研究表明，SARS-CoV-2的RNA(蓝色)可以在感染者体内转化为DNA，并插入他们的染色体。  

COVID-19康复患者一段时间后核酸检测复阳，一直是困扰学界的问题之一。到底核酸检测复阳是否具有感染性，是否需要隔离？ 检测到的病毒RNA在源于病毒还是源于整合到染色体的片段？

导致COVID-19大规模流行的SARS-CoV-2基因片段是否可以整合到我们的染色体中，并在感染结束后很长时间内仍然存在？一个著名的科学家团队对这个始终存在争议的假说进行深入研究，新的实验结果进一步提示了这种可能。如果他们是对的，那么这种插入现象或可以解释康复患者核酸检测复阳的现象，即从COVID-19中恢复的患者，几个月后又再次检测出SARS-CoV-2阳性。当然，也有怀疑论者认为这个实验结果可能只是实验室合成产物。

这项5月6日发表在《PNAS》上的新研究是由干细胞生物学家Rudolf Jaenisch和麻省理工学院基因调控专家Richard Young领导的。导致COVID-19的病毒SARS-CoV-2是一种正链RNA病毒。像其它β-冠状病毒（SARS-CoV-1和中东呼吸综合征相关的冠状病毒）一样，SARS-CoV-2采用依赖于RNA的RNA聚合酶复制其基因组并转录RNA亚基因组。在没有病毒繁殖的情况下继续检测到SARS-CoV-2病毒RNA的一种可能解释是，在某些情况下，病毒亚基因组RNA的DNA拷贝可以通过逆转录机制整合到宿主细胞的DNA中。在清除最初的感染后很长时间，整合的DNA拷贝的转录可能会导致PCR检测复阳。这篇文章的研究结果表明，“SARS-CoV-2 RNA可以被逆转录并整合到被感染细胞（培养细胞）的基因组中，并表达为整合序列和细胞序列的嵌合转录物。重要的是，在患者来源的组织中检测到这种嵌合转录物（仅转录产物）。数据表明，在某些患者组织中，所有病毒转录本的大部分都来自整合序列。这可能有助于解释为什么患者在康复后仍可以继续产生病毒RNA。”

研究发现SARS-CoV-2序列的DNA拷贝可以通过LINE1介导的逆转机制整合到宿主细胞基因组中。为增加检测罕见整合事件的可能性，实验是采用的是经LINE1表达质粒转染的HEK293T细胞，再用SARS-CoV的-2感染后分离DNA。通过PCR在受感染的细胞中检测到SARS-CoV-2核衣壳（NC）序列的DNA拷贝，并从细胞大片段DNA中克隆了完整的NC基因。结果表明SARS-CoV-2 RNA可以逆转录并且整合到宿主细胞的基因组中，其侧翼序列均包含LINE1核酸内切酶识别共有序列。这些结果表明SARS-CoV-2序列可以通过LINE1介导的逆转机制整合到培养的人细胞的基因组中。整合位点两侧具有病毒序列和LINE1核酸内切酶共有识别序列，与LINE1逆转录转座子介导、靶标引导的逆转录转座机制相符。

为了评估SARS-CoV-2序列的基因组整合是否也可以在不过度表达RT的受感染细胞中发生，我们从未被RT表达质粒转染的病毒感染的HEK293T和Calu3细胞中分离了DNA。TN5 tagmentation介导的DNA整合位点富集测序，一共有7个SARS-CoV-2序列融合到细胞序列在这些细胞中检测到。

事实上，在许多脊椎动物物种基因组中可检测到非逆转录病毒序列，甚至有生殖细胞中包含病毒mRNA通过LINE元件转为DNA并整合入基因组的痕迹，非逆转录病毒RNA病毒[如水泡性口炎病毒或淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）]可以通过内源性逆转录酶（RT）逆转录为DNA拷贝，并且病毒序列的DNA拷贝已显示可整合到宿主的DNA中细胞。此外，已显示细胞RNA（例如人APP转录本）在神经元中被内源性逆转录酶逆转录，并且所产生的APP片段可整合到基因组中并表达。人类LINE1元件（人类基因组的~17％）这种类型的自主逆转录转座子，其能够转座自己和其他非自主元件如Alu，成为细胞内源逆转录源。内源性LINE1元件已被证明在老化人体组织中表达，癌症患者中也存在着LINE-1介导的体细胞逆转录转座。此外，在病毒感染者中（包括SARS-CoV-2）内源性和LINE1表达通常呈现上调。

实际上，他们的团队在2020年12月首次在bioRxiv的预印本上提出了这一想法，用实验证明额外添加LINE-1元件的人类细胞被SARS-CoV-2感染后，SARS-CoV-2基因（RNA）的DNA版本出现在了细胞的染色体中。当时曾引发了一场Twitter争论。研究人员强调，病毒整合并不意味着从COVID-19中恢复的人仍然具有传染性。但有批评人士指责他们，令基于mRNA的COVID-19疫苗无端“躺枪”。

在新的PNAS论文中，研究小组提供了证据，表明LINE-1基因的一部分位于整合病毒基因序列的两侧，进一步支持了他们的假设。他们还与最初的怀疑论者之一，美国国家癌症研究所的Stephen Hughes合作，建议进行一项实验，根据整合病毒序列相对于人类序列的方向，来阐明整合是否真实。新论文的合著者Stephen Hughes说，研究结果支持了最初的假设。

LINE-1元件(逆转座子长散布核元件-1)是一种跳跃基因，据称约占据了人类基因组17%的序列，可能是古代逆转录病毒感染后的遗留产物，是目前在人类基因组中发现的唯一具有自主转座活性的转座子。LINE-1采用“复制-粘贴”的方式，以RNA为媒介，在基因组中进行转座易位。一般地，细胞中LINE-1的转座活性受到严格调控。而在肿瘤细胞中，LINE-1异常活化，以逆转座依赖或非依赖的方式, 影响基因组的稳定性:前者可以改变靶基因表达、引起染色质重排或协助其他转座子(如SINEs等)进行转座；后者为表观遗传的方式，通过产生内源的调节性RNAs、形成LINE-1嵌合性转录、形成新的剪切位点或启动位点来改变临近基因的表达等。

这个研究结果一方面有助于揭示康复患者出现核酸检测复阳现象，另一方面也令人对mRNA疫苗的安全性产生疑虑——mRNA一直被认为是脆弱的，不会整合到染色体上，因此mRNA疫苗是安全的。但是如果人体内存在LINE转座机制的情况下，外源的mRNA进入体内是否会被逆转录并转座到基因组DNA的某个位置，这个真是需要进一步研究。

生物通：对大家关心的核心问题，论文的结果部分最后两段描述得更加严谨和巧妙，但也干涩难懂，帖一小段，大家感兴趣可以再详细探究。

SARS-CoV2 RNA的复制需要负链病毒RNA的合成，该模板可作为病毒基因组RNA复制和病毒亚基因组正链RNA转录的模板。为了评估急性感染细胞中负链病毒RNA的比率，我们确定了总正链与负链RNA的比率。在急性感染的Calu3细胞或肺类器官中负链RNA占所有病毒数的比率介于0到0.1％，类似感染后早期采集的临床样本的报道。这些结果表明，在急性感染的细胞中，负链病毒RNA的水平至少比正链病毒RNA的水平低1,000倍，这至少部分是由于在病毒复制过程中大量产生了正链亚基因组RNA 。

与急性感染的Calu3细胞或肺类器官获得的结果相反，一些患者来源的组织中所有病毒读数的51％和人类病毒嵌合读数的42.5％来自于SARS-CoV-2负链。对患有严重COVID的患者的肺支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞进行单细胞分析显示，所有病毒读数中有多达40％来自于负链SARS-CoV-2 RNA。一些患者组织中负链RNA的分数比急性感染的细胞或类器官中的负链RNA的分数高几个数量级。在固定（福尔马林固定，石蜡包埋[FFPE]）尸检样本中，14例患者中有4例，而BALF样本中6例患者中有4例。至少约20％的病毒读数来自负链病毒RNA。与急性感染的细胞相反在这些尸检样品中几乎没有或没有证据表明病毒繁殖。在一名患者的样品中，很大一部分人-病毒嵌合读物中存在负链病毒序列（最高约40％）。来自同一患者的不同样品显示出相似程度的负病毒链-人类RNA读数。其他几例患者样本显示负链病毒-人RNA嵌合体阴性病毒的比例较低，但仍显着高于急性感染细胞中的水平，由于使用短读RNA-seq识别病毒-人类嵌合读物的能力有限，因此我们的分析未能显示出患者BALF样品中大量的嵌合读物，总而言之，我们的数据表明，在一些患者来源的组织中，SARS-CoV-2序列阳性细胞的总数可能很少，可能已从SARS-CoV-2序列转录了很大一部分病毒转录本整合到宿主基因组中。

原文检索：Further evidence supports controversial claim that SARS-CoV-2 genes can integrate with human DNA

参考文献：Reverse-transcribed SARS-CoV-2 RNA can integrate into the genome of cultured human cells and can be expressed in patient-derived tissues