在单细胞核测序中,如何对细胞核准确计数?

【字体: 时间:2021年07月09日 来源:生物通

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  为了获得可靠的结果,研究人员必须从样本中分离出细胞核,并准确地将它们与完整细胞和细胞碎片区分开来。在此过程中,我们必须对细胞核进行准确计数。那么,采取哪种方法好呢?

单细胞基因组学技术目前正应用得如火如荼,比如单细胞RNA测序(scRNA-seq)和染色质转座酶可接近性测序(ATAC-seq)。不过,为了获得可靠的结果,研究人员必须从样本中分离出细胞核,并准确地将它们与完整细胞和细胞碎片区分开来。

在此过程中,我们必须对细胞核进行准确计数。那么,采取哪种方法好呢?且看本文。

与传统的大量细胞测序方法相比,单细胞基因组学技术突出了细胞之间的差异,有助于更深入地了解样本材料。例如,scRNA-seq能够比较健康和疾病状态下的转录图谱,而ATAC-seq能够说明染色质可接近性及其对基因表达的影响。

不过,此类研究都需要对分离的细胞核进行准确计数,因为文库制备的要求是未裂解细胞的数量最低,且样本中不含细胞团块和碎片。此外,许多单细胞基因组学技术都需要完整的细胞核才能正常运行。

AO/PI染色比台盼蓝更可靠

人们通常采用细胞活力的指标对分离出的细胞核进行计数。台盼蓝染色便是最常用的方法之一,这种染料会被完整细胞排斥,使得细胞核无染色。不过,台盼蓝染色并不一定能准确分辨有核细胞和细胞碎片,因此它往往低估细胞总数而高估细胞活力。

出于这个原因,吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色是首选,无论是常规的细胞活力检测还是单细胞基因组学研究。在检测细胞活力时,活细胞经AO染色发出绿色荧光,而死细胞经PI染色发出红色荧光。重要的是,它避免了细胞碎片的检测。

这种方法最近也应用在单细胞基因组学应用上,其中绿色对应了完整细胞,而红色对应了成功分离的细胞核。这种策略让研究人员能够计算未裂解的残留细胞占总细胞数的百分比,同时对细胞核进行计数,提示样本质量,帮助研究人员确定是否继续进行单细胞基因组学流程。


图:台盼蓝染色法与吖啶橙/碘化丙啶染色法在评估细胞活力上的对比

全自动的细胞计数

对于经AO/PI染色的样本,我们可以在荧光显微镜下手动评估染色结果。不过,自动细胞计数仪能够提供更一致的结果。它不仅能够消除细胞计数过程中的用户偏差,还采用标准化方法来提高重复性并简化工作流程。与只提供明场(台盼蓝)检测的计数仪相比,基于荧光的细胞计数仪有望增强单细胞测序应用,因为它们具有更大的灵活性。

同时,在为单细胞基因组学研究选择自动细胞计数仪时,除了考虑荧光计数能力,还要考虑仪器对样本量的需求。由于样本材料通常很有限,因此只需要少量样本(5–10 µL)的仪器通常更适合。从环保的角度考虑,不需要载玻片的设计当然是更好的选择。不过,使用载玻片也有好处,那就是可以将材料转移到高倍显微镜下,以分析细胞核完整性。

此外,在处理颇具挑战性的样本时,比如组织裂解物,AO/PI染色相对于台盼蓝的优势更加明显。组织裂解物中包含大量碎片,若是用台盼蓝染色很可能被误认为是活细胞,而且细胞核是否完整无法区分。

研究人员曾使用自动细胞计数仪对从小鼠大脑中分离出的细胞核进行计数,并将两种方法进行比较。台盼蓝染色后计算出的细胞活力为54%,而AO/PI染色的测量值仅为1.8%,且手动计数证实了后一个结果。台盼蓝方法没有对部分细胞核进行计数,这也凸显了在单细胞基因组学应用中使用AO/PI染色的重要性。

市场上有不少荧光细胞计数仪,比如CellDrop荧光/明场细胞计数仪。它无需使用耗材,将加样、测量和擦除模式完美地应用在细胞计数领域。明场成像时间小于3秒,荧光成像时间小于8秒,让细胞计数效率大大提高。

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