ScienceAdvance:CRISPR编辑小鼠揭示线粒体酶突变与糖尿病的关系

目前中国糖尿病人或已超过1亿，全球占比超过四分之一。其中II型糖尿病占比超过9成。糖尿病致病机理的研究非常重要。这项研究分析线粒体上一个新发现的突变对胰岛素分泌和线粒体钙释放的影响，对糖尿病管理和预防可能有重要意义。

　　

胰岛素抵抗和胰岛素分泌受损是 II 型糖尿病的主要缺陷。能量产生受损、能量储存的使用和线粒体功能障碍是代谢疾病的主要特征。普遍认为线粒体能量代谢障碍在胰岛素抵抗的病理生理学中起重要作用。然而，线粒体功能障碍如何导致、促成或导致胰岛素抵抗和代谢疾病仍为未确定。过往研究表明，编码线粒体蛋白质的基因中的突变，会促进共同代谢性疾病如II型糖尿病，胰岛素抵抗，肥胖和癌症的代谢功能障碍。来自遗传和全基因组关联研究 (GWAS) 的越来越多的证据表明，线粒体 DNA (mtDNA) 的遗传变异会导致这些常见的代谢疾病——然而，这些发现基本上没有经过体内功能验证。

线粒体基因组编码 13 种蛋白质，它们都是电子传递链和三磷酸腺苷 (ATP) 合酶的重要组成部分，负责通过氧化磷酸化 (OXPHOS) 产生能量。mtDNA 中的突变最常导致线粒体疾病，并且在某些情况下，会参与胰岛素分泌受损而导致糖尿病的发生和发展)。尽管这些病理的分子机制尚不清楚，主要被认为与 OXPHOS 功能障碍有关。人类 mtDNA 是环状的，基本上没有非编码序列，编码 11 种 mRNA、22 种转移 RNA (tRNA) 和 2 种核糖体RNA (rRNA)——几乎覆盖整个mtDNA全长。 mtDNA 基因中缺乏内含子——不需要剪接；而散布在 mRNA 和 rRNA 编码基因之间的 tRNA 基因能够募集 tRNA 加工酶以产生特有的转录本。线粒体 RNA 加工涉及核糖核酸酶 (RNase) P 在 tRNA 5' 末端的切割和由ELAC2基因编码的线粒体 RNase Z 切割 3' tRNA 末端。如果RNA加工过程异常，将对线粒体和核基因表达，蛋白质合成产生深刻的影响，对呼吸链的组装和功能造成影响，导致过早死亡。

线粒体 RNase P 是一种蛋白质复合物，不含催化性 RNA，由三种蛋白质组成：线粒体 RNase P 蛋白 1（MRPP1，也称为 tRNA 甲基转移酶 10C 同源物，TRMT10C）、MRPP2 （HSD17B10，羟基类固醇 17-β 脱氢酶 10）和 MRPP3 （也称为 RNase P 催化亚基 (PRORP)  )。尽管 MRPP3 具有催化 RNA 切割功能，但所有三种蛋白质都是 RNase P 活性所必需的。RNase P 任何成分的功能障碍都会影响 RNA 加工，对能量代谢产生可怕的后果。 RNase P 成分的丢失或突变可直接导致小鼠胚胎致死，破坏 5' tRNA 加工导致严重的多系统疾病和过早死亡。除了促进 RNase P 复合物中的 tRNA 加工外，MRPP1 和 MRPP2 在线粒体中还有其他作用。MRPP1还兼职做甲基转移酶，修饰线粒体tRNA的9位的鸟嘌呤或腺嘌呤；而MRPP2是短链脱氢酶超家族的成员，是支链氨基酸（BCAA）和类固醇激素代谢所需要的。

线粒体核糖核酸酶 P 亚基 3 ( MRPP3 ) 基因编码一种 RNA 结合蛋白，最近从中发现了一个错义变异体（rs11156878、Asn437Ser），线粒体 tRNA 9 位甲基化变异中 22%是这种突变导致的，占人群比例的19%。 研究人员分析了该变异如何影响线粒体转录组和功能。研究人员使用 CRISPR-Cas9 基因组编辑在小鼠Mrpp3基因中引入 rs11156878 突变，证实在高脂肪饮食 (HFD) 中该突变通过扰乱胰岛素分泌使胰腺 β 细胞脱敏，胰岛素分泌减少导致胰岛素水平降低，使高脂肪饮食 Mrpp3变异小鼠的代谢失衡和肝脏脂肪变性。该变异未显着影响线粒体基因表达，但减少了线粒体钙，从而降低了Mrpp3突变小鼠中胰岛 β 细胞的胰岛素释放。研究为分析人群中胰岛素抵抗的潜在诱发因素提供了功能和机制证据。

根据GWAS 预测，影响代谢功能和线粒体表观转录组的这种Asn437Ser突变，在人群中以不同的频率存在，最高影响欧洲人口的 15% 到 19%，其次是亚洲的 6% 到 11%，最低的是 非洲的3% 到 6 %。437 位的天冬酰胺从人类到啮齿动物都是保守的。MRPP3 或 PRORP 酶的原子结构表明，它包含一个金属核酸酶结构域（执行 tRNA 的内切核酸酶切割）和一个中心连接头、以及参与 tRNA 结合的五个串联五肽重复序列 (PPR) RNA 结合结构域。Asn437Ser突变位于催化域的表面，远离 MRPP3 的催化位点，突变不会改变催化域表面的局部电荷分布。

研究人用 CRISPR-Cas9 技术将等效的 Asn434Ser 变体敲入小鼠Mrpp3基因，以研究其与野生型Mrpp3基因相比对代谢、线粒体转录组和能量产生的影响。基因型通过Sanger测序得到证实。小鼠错义突变的氨基酸位于高度保守区，与人类MRPP3突变相同，与野生型 MRPP3 相比，不影响其丰度。用正常食物 (NCD) 或 高脂肪饮食HFD分别喂养雄性wt小鼠和同窝突变仔鼠（N434S）14 周。相比野生型，所述N434S小鼠在正常饮食组中体重较低、表型较，但高脂肪组两者没有明显差异。与wt对照小鼠相比，葡萄糖耐量试验 (GTT) 显示N434S小鼠在两种饮食中均轻度葡萄糖不耐受；胰岛素耐量试验（ITT）表明高脂肪饮食的突变小鼠N434S出现胰岛素不敏感。这些发现表明 Asn434Ser 突变可能导致高脂饮食下的胰岛素抵抗。HFD的突变小鼠循环胰岛素水平降低，胰岛大小增加，并导致肝脏脂肪变性。线粒体 RNA 加工和翻译后 tRNA 修饰在功能上不受N434S突变的影响。但MRPP3 N434S突变 对胰腺功能和分泌胰岛素的胰腺 β 细胞的影响最为显著，导致线粒体钙释放和胰岛素分泌减少，降低了胰岛细胞的敏感性，使突变个体更易患代谢功能障碍。在 HFD 的额外压力下，胰腺胰岛素分泌减少和随之而来的循环胰岛素水平降低的下游后果导致肝脏中脂质积累增加和骨骼肌中葡萄糖摄取减少。尽管 MRPP3 在线粒体基因表达中起作用，但该突变不影响 OXPHOS 生物发生及其功能；相反，胰岛素分泌受损是线粒体钙释放受损的结果。

人类基因组中的变异积累对于适应不同的营养供应和需求至关重要。例如，像北极这样的极端栖息地导致因纽特人选择线粒体肉碱棕榈酰转移酶蛋白 (CPT1A) 中的一种突变——因为这为富含脂肪的饮食的代谢提供了选择性优势，这是这种土著人的典型特征。目前尚不清楚为什么在高达 19% 的欧洲人群中保留了MRPP3 中的rs11156878突变，这可能是因为它可以通过在正常饮食条件下上调胰岛素分泌来提供优势。然而，这种遗传突变在富含脂肪的饮食 (HFD) 中易患胰岛素抵抗，因为线粒体无法调动其储存在胰腺中的钙水平来增加胰岛素分泌。这一发现可能有助于管理人群中大量个体的营养，以预防或延缓胰岛素抵抗的发生和 II 型糖尿病的潜在发展。