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原代细胞培养不好?这些问题,你注意到了吗?

【字体: 时间:2021年09月07日 来源:基因有限公司

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  原代细胞培养的流程大致包括:细胞复苏、传代培养及冻存。即使你经验丰富,也可能会忽视某些方面。若稍有不慎,就会出现细胞不健康,甚至死亡的后果。今天小编就带大家看看原代细胞培养中一些容易忽略的问题。

原代细胞状态不好,长不起来怎么办?哎,下次汇报我没有什么新的结果怎么办!不知道为何细胞长着长着就变样了呢?是否有过类似的情况?

原代细胞培养的流程大致包括:细胞复苏、传代培养及冻存。即使你经验丰富,也可能会忽视某些方面。若稍有不慎,就会出现细胞不健康,甚至死亡的后果。今天小编就带大家看看原代细胞培养中一些容易忽略的问题。

“不希望你的原代细胞脾气暴躁,那就要注意这些问题”

  • 这里有个非常关键的问题--准备!确保你准备好了你需要的一切。

例如,是否准备好无菌移液管和枪头,并且已经将特定培养基放在培养箱中预热。说到预热:你最近有用水银温度计或酒精温度计检查过水浴锅温度吗?还是你盲目地相信显示器上的数字呢?事实证明,这往往是导致致命后果的主要原因之一。如果温度高于37°C,细胞将受到影响。如果温度太低,解冻时间就太长,细胞就会受到不可逆转的损伤。

  • 做好充分准备后,就到了第二个关键点--时机!

你只有五分钟的时间将细胞从液氮中取出,解冻,最后将其转移到培养箱中--时间不多。尤其是要把细胞竖直放在水浴中1-2分钟解冻--不要用漂浮物固定。所以需要快,同时,要对细胞温柔,不要像疯子一样上下颠倒移动。有个非常生动的比喻:原代细胞就像人类一样。如果你试着轻轻地抚摸它们来唤醒他们,他们最终会起床--但他们上班会迟到。另一方面,如果你用力摇晃它们,它们会很快醒来--而且会整天脾气暴躁。这就需要我们在速度和温柔之间取得良好的平衡。此外,要注意保持水浴锅清洁,不然细胞很容易污染。

“幸福的密度--必须注意的问题”

  • 当细胞密度为70-90%时,这是细胞传代培养的理想时机。

细胞需要周围的朋友才能快乐--不是太少,也不是太多。同样,这和人类一样--我们大多数人在拥挤的地方会感觉不舒服。此外,与大多数细胞系相比,一些原代细胞在达到完全融合时就会发生分化,所以传代时细胞密度的控制非常重要。

  • 在培养瓶中选择合适的密度可以带来双赢的局面:你可以拥有大量的细胞,同时,选择合适的胰蛋白酶和终止液对细胞消化解离非常重要。

胰蛋白酶的浓度非常关键,市面上销售的胰蛋白酶溶液的胰蛋白酶浓度大多数为0.05%或更高,可能会损害原代细胞。建议使用0.04%胰蛋白酶/0.03%EDTA溶液对正常人细胞进行传代培养,对细胞损伤小。

有人问:能用生长培养基来终止胰蛋白酶吗?一般需要使用浓度>10%的FBS来完全灭活胰蛋白酶,但原代细胞培养基大多是低血清或无血清的,如果加入高浓度血清来终止胰蛋白酶会影响后续细胞培养,因此强烈建议使用不含血清的胰蛋白酶抑制剂。


在合适的条件下,原代细胞,如HUVECs在培养基中生长。70-90%的密度是开始传代的理想条件。
在这个融合水平上,胰蛋白酶等蛋白酶分离细胞而不会造成太大的损伤。

“让你的原代细胞醒来充满活力—冻存不得不说的问题”

  • 冻存对细胞来说总是有刺激的,并且会缩短它们的寿命。不管你做什么,细胞都会记住冻存前的传代次数。你不能延长他们的寿命——没有魔法。如果你不能避免冻存,你至少应该尽可能早地进行,并且尽量减少传代次数。
  • 许多实验室都有自己的冻存细胞方案,通常需要使用含有高浓度血清和二甲基亚砜的培养基,但是要知道血清中含有很多未知因素。

由于原代细胞对刺激反应强烈,血清会通过触发不受控制的信号通路来影响它们,此外,高浓度的DMSO也会损伤细胞。为了弥补这一点,你需要在开始培养前通过离心来清洗细胞--这同样会给你的细胞带来刺激。建议使用无血清,DMSO浓度非常低的冻存液,以利于提高细胞复苏后的活力。

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