【方法推荐】类器官研究应用第一弹

在类器官成像过程中，Cytation5可以对类器官的培养过程进行长时间的动力学检测成像，并且可以实现明场和不同荧光场的多通道色彩叠加，满足不同的成像检测需求。

类器官作为一种相对新颖的生物研究模型，具有比2D细胞更为复杂的人体组织生理学特征，能够更好地反应不同细胞类型之间的细胞通讯，更好地模拟体内微环境，因此常被用于临床前阶段的药物测试，以评估机体对药物刺激的响应。Cytation5细胞成像微孔板检测系统作为一款功能强大的成像检测设备，不仅能够对2D细胞、3D细胞进行成像检测，同样也能够对类器官进行成像研究，在这一过程中，Cytation5可以对类器官的培养过程进行长时间的动力学检测成像，并且可以实现明场和不同荧光场的多通道色彩叠加，满足不同的成像检测需求。

应用分享

案例一 Cytation5助力研究小肠和大肠器官的放射敏感性

Maria Laura Martin等人在Cancer Research上发表的文章“Organoids reveal that inherent radiosensitivity of small and large intestinal stem cells determines organ sensitivity”，通过构建大肠和小肠的类器官模型研究了大肠和小肠器官对电离辐射的敏感性。在本研究中，作者首先对从Lgr5-LacZ转基因小鼠的隐窝中产生的类器官进行研究，通过不同剂量的电离辐射处理，评估了其对胃肠道的损伤，并研究了不同剂量辐射对小肠类器官细胞的活性影响。另外，通过比对发现，大肠类器官比小肠类器官具有更强的抗辐射能力（图2A、B），并且在经过传代之后得到的数据结果与此相一致（图2C、D）。

图2 大肠和小肠类器官的电离辐射敏感性分析。A、B.从刚分离的隐窝培养7天的大肠和小肠类器官
在不同辐射强度下辐照24h后的表型分析及其剂量存活曲线；C、D.传代后的大肠和小肠类器官
在不同辐射强度下辐照24h后的表型分析及其剂量存活曲线。

为了进一步评估小肠和大肠干细胞固有的放射敏感性，作者使用高纯度的Lgr5+肠干细胞培养系统，通过不同的辐射强度处理，同样得到大肠类器官比小肠类器官有更强的抗辐射能力的结果（图4），说明大肠和小肠器官对电离辐射的敏感性是由Lgr5+干细胞的固有放射敏感性所决定的。

图4 纯干细胞集落培养的小肠和大肠类器官的放射敏感性。A、B.单个Lgr5-GFP细胞培养7天的小肠和大肠
集落不同辐照下的表型分析；(C) 小肠和大肠干细胞集落的剂量生存曲线。

该研究通过体外辐射敏感性实验对之前体内发表的数据进行了验证，并证明了大肠和小肠的辐射敏感性是由Lgr5+干细胞群体的固有放射敏感性所决定的。另外，该研究对测试患者源性类器官的辐射反应、准确评价肠道病理生理状态以及药物筛选具有重要意义。

案例二 Cytation5助力3D打印牛结肠类器官的建立以及冷冻多孔平台的筛选

Elfi Töpfer等人发表了文章“Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms”，在该文章中，作者构建了牛结肠类器官，并通过基因表达实现组织特异性分化。在这一过程中，作者通过合适的培养条件从隐窝中培养形成结肠类器官（图2A），并且，在该培养条件下，经过传代的细胞集落也同样可以形成完整的类器官球体（图2B）。

图2 牛结肠类器官的建立。A.结肠类器官在0-3天的生长状态；B.传代培养的类器官的生长状态。

3D培养的结肠类器官是进行中等通量药敏试验和细胞毒性研究的有效工具，但3D类器官的构建需要花费复杂和长时的培养工作，因此在该研究中，作者通过一种新的板内冷冻保存技术，使得培养的3D结肠类器官可以在多孔板内进行原位冷冻保存，并且在解冻后，其3D类器官的生长状态与未冷冻培养的相一致，对药物的敏感性也没有明显差异（图3A）。

图3A 对照和冷冻培养的结肠类器官的生长状态及对药物的敏感性。

另外，在该研究中，作者通过3D生物打印技术将结肠类器官打印到96孔板中，在这个过程中，作者用7.5%的GelMA对类器官进行培养，其结果类似于Matrigel的培养方式（图4B）。此外，作者也对成功打印的结肠类器官的结构完整性和活性进行评估（图4E，F），验证了打印的结肠类器官仍然可以存活和增殖，并保持完整的结肠类器官-GelMA结构。

图4 牛结肠类器官在生物打印中的应用。B.标准Matrigel培养方式(左)和7.5% GelMA培养方式(右)培养三天的
类器官生长状况；D.打印后1小时的类器官活性；E.打印后48 h的增殖情况。

在整篇研究中，作者多次使用BioTek的设备来获得实验数据，其中，对明场的类器官成像和荧光场的细胞增殖、细胞活力检测都是通过BioTek Cytation5实现的，而对线粒体活性检测（基于刃天青染料的荧光检测法）和3D细胞活力检测（基于ATP定量的生物发光检测法）都是通过BioTek Synergy H4多功能微孔板检测系统实现的，可见作者对BioTek产品的信赖。

案例三 Cytation5助力研究恶性腹水源性类器官在胃癌体外建模和药物筛选中的应用

湛先保等人发表了文章“Malignant ascites‑derived organoid (MADO) cultures for gastric cancer in vitro modelling and drug screening”，该研究从胃癌的恶性腹水中建立了三维的体外类器官培养物，可以用于疾病建模和药物的筛选。首先，作者利用胃癌恶性腹水肿瘤细胞制备11个恶性腹水肿瘤类器官（MADOs），并对其培养体系进行优化发现，10%、25%和50%的上清浓度能够显著提高类器官形成效率和类器官大小（图1B），但过高浓度的MA上清会抑制MADOs的生长（图1C）。另外，建立的11个MADOs在生长速率和形态上也表现出较大的多样性（图1D）。

图1 B.不同上清浓度(0，10%，25%，50%)对MADOs生长的影响；C. MADOs在不同上清浓度
(0、10%、25%、50%、100%)孵育下的生长面积统计散点图；D. MADOs形态特征。

为了评估MADOs在体外疾病模型中的功能，作者用7种胃癌临床药物进行高通量药物敏感性筛选，并通过Cytation 5细胞成像微孔板检测系统对药物处理后的类器官进行成像，对其相对活性变化进行分析（图4）。结果发现，MADOs对标准的化疗药物表现出异质性反应，因此，可以作为功能性体外疾病模型。

图4 药物处理后MADOs的敏感性分析（相对敏感药物用红色框标记）。

从以上几个案例不难看出，BioTek Cytation 5已经被广泛应用于类器官研究，通过Gen5软件的Z轴层扫叠加和Montage拼接功能，结合明场和多通道的荧光场成像模式以及长时间动力学检测方式和多种高内涵算法，Cytation 5可以帮助您在类器官研究中如鱼得水，锦上添花。

参考文献
[1] Martin ML, Adileh M, Hsu KS, et al. Organoids Reveal That Inherent Radiosensitivity of Small and Large Intestinal Stem Cells Determines Organ Sensitivity[J]. Cancer Research, 2019, 256(4):canres.0312.2019.
[2] Tpfer E, Pasotti A, Telopoulou A, et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms[J]. Toxicology in Vitro, 2019, 61:104606.
[3] Li J, Xu H, Zhang L, et al. Malignant ascites-derived organoid (MADO) cultures for gastric cancer in vitro modelling and drug screening[J]. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 2019, 145(11):2637-2647.

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