等温扩增 vs. PCR扩增,你pick谁?

【字体: 时间:2022年02月25日 来源:生物通

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  在对DNA样本进行测序之前,通常需要对其进行扩增。PCR是最为常用且广为人知的扩增方法,但还有另一种选择,那就是等温扩增。本文将介绍等温扩增和PCR扩增方法的特点以及如何选择。

在对DNA样本进行测序之前,通常需要对其进行扩增。PCR是最为常用且广为人知的扩增方法,但还有另一种选择,那就是等温扩增(isothermal amplification)。温度是否变化,是等温扩增和PCR扩增之间的主要区别。

在PCR中,热循环仪反复改变反应温度,影响各种试剂的作用;相比之下,等温扩增方法则在单一温度下扩增DNA,它采用链置换DNA聚合酶,在沿着双链DNA移动时“解开”链,而不是像PCR那样采用热变性。

等温扩增方法有多种类型,包括链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、全基因组扩增(WGA)、环介导等温扩增(LAMP)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和多重置换扩增(MDA)等。下面我们将介绍等温扩增和PCR扩增方法的特点以及如何选择。

PCR vs. 等温扩增

扩增方法的选择通常取决于具体应用和现有设备。虽然PCR广泛用于扩增,但它需要使用热循环仪。对于实验室来说,这也许根本不算事儿,不过对于诊断应用而言,这可能就是个缺点。

如果有热循环仪,PCR扩增是一个相对简单的过程,对稀有转录本来说也是个更好的选择。相比之下,等温扩增特别适合那些无法使用热循环仪的情况,例如诊所、野外工作或家庭自检,而且有时候更快速、更简单,也更经济。

与PCR相比,等温扩增的灵敏度或特异性有时比较低,但这可以通过优化反应来改善1。PerkinElmer Genomics的首席科学官Madhuri Hegde也认为,等温扩增可能会受到非特异性的影响。“临床应用需要一种高度灵敏且特异的检测,这同样适用于科研和发现工作,以避免假阳性结果,”她说。不过,等温扩增方法也在不断改进,并推动COVID-19检测的创新。

在某些情况下,两种方法的信息量是不同的。PCR专门检测感兴趣的目标,Tecan的单引物等温扩增(SPIA)则不同,它是一种全转录组方法,可帮助用户检测感兴趣的目标以及其他相关信息,如共存的病原体或宿主信息。

Tecan Genomics的营销和产品管理副总裁Rupert Yip认为:“选择SPIA还是PCR,取决于所需的信息水平。如果只需要有限的信息,那么PCR就足够了,但如果还需要样本的其他信息,那么SPIA可提供更好的解决方案。”

在SPIA扩增过程中,酶复合物附着在cDNA上,并生成每个分子的100-1000份拷贝。SPIA可扩增低起始量或降解的RNA样本,或检测稀有转录本,比如病毒RNA。“它扩增了整个转录组,是一种很有效的信号放大方法。扩增后的cDNA可用于各种检测方法,如qPCR和NGS,以确定特定病毒是否存在,”Yip谈道。

等温桥式扩增

还有一种特殊类型的等温扩增,被称为桥式扩增,应用在Illumina的新一代测序平台中。它可以扩增模板,生成数百万个序列簇,而且只需极少的手动操作。它与大多数等温扩增方法的不同之处在于它是循环进行的,采用变性剂来分离双链DNA(类似于PCR中的加热步骤)。

不过,“这种方法的缺点是,每个扩增循环都需要添加新鲜混合物(包含聚合酶),然后进行化学变性步骤,这使得它的成本远高于常规PCR,”Hegde说。

一种原位的固相等温扩增也许可以替代桥式扩增,应用于新一代测序中。它基于DNA复制的模板步移机制,在固体表面使用低熔点均聚物引物(如polyA),在溶液中使用低熔点模板引物。Hegde称:“这种方法简单快速,经济高效,且适用于双端测序。”

噪声抑制技术

Tecan的SPIABoost技术能够阻断非目标序列的扩增,从而抑制不想要的信号,否则这些信号可能会压过您感兴趣的信号。例如,唾液样本中通常包含人类转录本和病毒转录本,而SPIA能够在扩增病毒RNA的同时阻断人类rRNA序列。

这种噪声抑制技术可提高稀有转录本的发现能力。“举个例子,你可以用它来寻找与克罗恩病相关的微生物,”Yip说。“或者,如果你正在血液样本中寻找与癌症相关的稀有信号,你可以采用SPIA和噪声抑制来降低其他信号并增强癌症信号。”

等温扩增的应用

Yip指出,许多人在微生物组和传染病研究中采用SPIA来检测稀有转录本。“我们有一名客户使用抑制人类rRNA的SPIABoost,在脑脊液中确定脑膜炎感染的早期迹象,”他说。

伦敦帝国理工学院和莱斯特大学的研究人员利用等位基因特异性的LAMP分析来检测乳腺癌中的一个常见驱动突变2。尽早发现这种突变有助于医生和患者做出重要的治疗决策。

研究人员还用SPIA来研究蚊子唾液,这是寨卡病毒和登革热病毒的载体。“噪声抑制可以去除高背景,也就是蚊子rRNA,增加从蚊子唾液中回收的病毒信息,”Yip谈道。“SPIABoost可针对几乎任何物种的任何转录本来设计,以便降低背景,并提供信息更多的读数。”

研究人员也将等温扩增方法应用在COVID-19检测上。例如,葡萄牙的研究人员基于RT-LAMP开发出一种COVID-19比色检测3。检测在一个试管中进行,使用鼻腔拭子或唾液样本,只需要30分钟,特别适合即时检测或资源不足的地区。

尽管没有RT-PCR检测那么灵敏,但这种RT-LAMP检测可用来检测和筛查无症状感染者和症状前期感染者。在实验室资源紧缺的条件下,这种阻止流行病传播的能力也是有优势的。

此外,布罗德研究所和波恩大学的研究人员开发出一种名为LAMP-Seq的扩增方法,可在单个步骤中添加分子条形码并扩增鼻腔拭子样本4。这样就能够大规模混合样本并开展高通量的新一代测序分析。LAMP-Seq的灵敏度和特异性高,材料成本低,且检测时间不到24小时,有助于缓解目前检测奥密克戎变体时的资源短缺局面。

参考文献

1. Ozay, B., et al. A review of reaction enhancement strategies for isothermal nucleic acid amplification reactions. Nov 2021. Sensors and Actuators Rep 3:100033
2. Kalofonou, M., et al. A novel hotspot specific isothermal amplification method for detection of the common PIK3CA p.H1047R breast cancer mutation. March 2020. Sci Rep 10:4553
3. Amaral, C., et al. Amaral, C., Antunes, W., Moe, E. et al. A molecular test based on RT-LAMP for rapid, sensitive and inexpensive colorimetric detection of SARS-CoV-2 in clinical samples. August 2021. Sci Rep 11, 16430.
4. Ludwig, K.U., et al. LAMP-Seq enables sensitive, multiplexed COVID-19 diagnostics using molecular barcoding. June 2021. Nat Biotechnol 39, 1556–1562.

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