新的DNA修复工具包成功修复患者来源的细胞中的遗传性疾病

使用一种可能改变游戏规则的DNA修复工具包，在患者提取的肾细胞中修复导致儿童和年轻人衰弱遗传性肾脏疾病的基因突变。

　　

在这项新研究中，国际研究小组描述了他们如何创造出一种DNA修复工具来从基因上修复有缺陷的podocin，这是一种遗传性类固醇抵抗性肾病综合征(SRNS)的常见遗传原因

Podocin是一种位于特殊肾脏细胞表面的蛋白质，对肾脏功能至关重要。然而，有缺陷的podocin会滞留在细胞内，永远无法到达表面，最终破坏足细胞。由于这种疾病不能通过药物治愈，修复导致podocin缺陷的基因突变的基因疗法给患者带来了希望。

通常，人类病毒已经被用于基因治疗应用来进行基因修复。它们被用作“特洛伊木马”，进入携带错误的细胞。目前主要的系统包括慢病毒(LV)、腺病毒(AV)和腺相关病毒(AAV)，它们都是相对无害的病毒，容易感染人类。然而，这些病毒都有相同的局限，它们都局限在病毒壳内的空间中。这反过来又限制了它们可以运送的货物的数量，即高效基因修复所需的DNA试剂盒，这大大限制了它们在基因治疗中的应用范围。

布里斯托尔生物化学学院的Francesco auicino博士和Imre Berger教授领导的团队运用合成生物学技术，重新设计了杆状病毒，这是一种对人类无害的昆虫病毒，不再受限于有限的货物容量。

“杆状病毒与LV、AV和AAV的区别在于，它没有一个坚硬的外壳来封装货舱。”这项研究的负责人弗朗西斯科·奥里西诺博士说。杆状病毒的外壳就像一根空心的棍子——当货物增加时，它会变长。这意味着杆状病毒可以提供更多复杂的工具来修复基因缺陷，使其比常用的系统更通用。

首先，杆状病毒必须具备穿透人体细胞的能力，这是它通常无法做到的。奥里奇诺博士解释说:“我们用蛋白质装饰了杆状病毒，使其能够非常有效地进入人类细胞。”这种改良的杆状病毒被认为是安全的，因为它只能在昆虫中繁殖，而不能在人类细胞中繁殖。然后，科学家们利用改造过的杆状病毒传递了比以前更大的DNA片段，并将这些片段构建到一系列人类细胞的基因组中。

人类基因组中的DNA由30亿个碱基对组成，约有2.5万个基因，它们编码细胞功能所必需的蛋白质。如果我们的基因中出现错误的碱基对，就会产生错误的蛋白质，从而使我们生病，导致遗传性疾病。基因疗法有望通过纠正我们基因组中的这些错误，从根本上修复遗传性疾病。基因编辑方法，特别是基于CRISPR/ cas的方法，通过实现碱基对精度的基因修复，极大地推动了该领域的发展。

该团队使用了患者衍生的带有致病错误的基因组的足细胞来证明他们的技术的能力。通过制造一种DNA修复试剂盒，包括基于蛋白质的剪刀和指导它们的核酸分子，以及替换错误基因的DNA序列，该团队向单一工程杆状病毒交付了一份健康的podocin基因副本，同时使用CRISPR/Cas机制，以碱基对的精度将其插入基因组。这能够逆转致病表型，并恢复细胞表面的podocin。

Imre Berger教授解释说:“我们以前用杆状病毒感染培养的昆虫细胞，以产生重组蛋白，研究它们的结构和功能。”这种名为MultiBac的方法由伯杰实验室开发，在世界各地的实验室中已经非常成功地制造了具有许多亚基的非常大的多蛋白复合物。“MultiBac已经利用杆状病毒外壳的灵活性，将大片段DNA传递到培养的昆虫细胞中，指导它们组装我们感兴趣的蛋白质。”当科学家们意识到同样的特性可能会改变人类细胞中的基因疗法时，他们开始着手创建他们发表在出版物上的新系统。

奥里奇诺博士补充说:“有很多途径可以利用我们的系统。除了podocin修复，我们还可以证明，通过使用我们的单杆状病毒投递系统和最新的编辑技术，我们可以同时有效地纠正基因组中不同位置的许多错误。”

“SRNS是影响肾脏的最常见的遗传疾病之一”Moin Saleem教授说，他是布里斯托尔肾遗传疾病基因治疗的主要专家。“SRNS的特点是早期肾衰竭，导致患者的生活质量严重下降。”

布里斯托尔肾脏大学的肾脏细胞生物学教授加文·威尔士总结道:“这些结果非常令人鼓舞。Berger团队开创的这种新方法不仅对SRNS有希望，而且对一系列其他肾脏遗传疾病也有希望，这些疾病目前的技术无法有效地进行基因修复。要实现一种新的载体系统用于临床应用，还有很长的路要走，但我们相信，它所提供的优势使这项工作非常有价值。”

这项研究获得了欧洲研究理事会(ERC)、英国肾脏研究(KRUK)和EPSRC/BBSRC布里斯托合成生物学研究中心(BrisSynBio)的资助。

关于类固醇抵抗性肾病综合征(SRNS)

遗传性SRNS是一种严重影响儿童和年轻人的肾脏疾病。它是由基因突变引起的，这些基因对肾脏专门的滤过细胞——足细胞的功能很重要。这些疾病目前还没有可用的治疗方法，并导致肾衰竭的快速发作，需要透析和移植。

Journal Reference:

1. Francesco Aulicino, Martin Pelosse, Christine Toelzer, Julien Capin, Erwin Ilegems, Parisa Meysami, Ruth Rollarson, Per-Olof Berggren, Mark Simon Dillingham, Christiane Schaffitzel, Moin A Saleem, Gavin I Welsh, Imre Berger. Highly efficient CRISPR-mediated large DNA docking and multiplexed prime editing using a single baculovirus. Nucleic Acids Research, 2022; 50 (13): 7783 DOI: 10.1093/nar/gkac587