DNA Extractor® Kit 实验方案
■ 方案1:血清中DNA 提取操作步骤
试剂准备:
1) DNA 提取之前,试剂提取如下:
26 ml 碘化钠溶液加入6 ml 蒸馏去离子水稀释,
再加入1 ml 月桂酰肌氨酸钠和65 μl 糖原溶液并混合均匀。
2) 向洗涤溶液(B)加入2 μl 糖原溶液并立即混合均匀。
注意事项:
1) 用于稀释Nal 溶液的蒸馏去离子水须去除DNA。
2) 配制好的洗涤溶液(B)在4℃至少能保存一周。如果需要少量的洗涤溶液(B),加入糖原
溶液到无菌离心管中至合适体积即可。
3) 在保存期间Nal 溶液会结晶,加热溶液至50℃可帮助溶解。
DNA 提取步骤:
1) 吸取100 μl 的血清样品加入1.5 ml 微量离心管;
2) 再加入300 μl 配制好的Nal 溶液至离心管并混合均匀;
3) 将离心管在60℃恒温容器中加热15 分钟;
4) 取出离心管,加入400 μl 异丙醇至离心管并混合均匀;
5) 离心管在室温静置15 分钟后离心10,000 g 15 分钟;
6) 尽可能多地吸取上清液,将离心管倒置在纸面上除去残留溶液;
7) 加入1 ml 配制好的洗涤溶液(B)重悬浮得到的白色沉淀,并使白色沉淀从离心管壁上弹开;
8) 短暂离心10,000 g 5 min,去除上清液,将剩余沉淀真空干燥,用于后续的DNA 分析。
■ 方案2: Threshold* 系统DNA 定量法的预处理
试剂预处理:
1) 将65 μl 糖原溶液加入26 ml 碘化钠溶液;
2) 将2 μl 糖原溶液加入40 ml 洗涤溶液(B),立即混合均匀。
注意事项:
1) 用于稀释碘化钠溶液的蒸馏去离子水须去除DNA。
2) 配制好的洗涤溶液(B)在4℃至少能保存一周。如果需要少量的洗涤溶液(B),加入糖原
溶液到无菌离心管中至合适体积即可。
3) 在保存期间碘化钠溶液会结晶,加热溶液至50℃可帮助溶解。
4) 提取步骤应在DNA 变性之前,因此重要的是使用无菌技术尽可能降低DNA 污染。预先包装好的无菌吸管、无菌试管和手套都要经过此步骤。
DNA 提取步骤:
1) 吸取400 μl 或500 μl 的样品加入2 ml 无菌带盖微量离心管并混合均匀;
2) 吸取20 μl 的月桂酰肌氨酸钠溶液加入微量离心管并混合均匀;
3) 再加入500 μl 包含糖原的碘化钠溶液至混合溶液,涡旋后在40℃保温15 分钟;
4) 加入900 μl 异丙醇至混合溶液,涡旋后静置于室温15 分钟;
5) 短暂离心10,000 g 15 min 后,能看见管壁有白色沉淀,吸取上清液后将离心管倒置于纸面去除残留溶液;
6) 加入800 μl 洗涤溶液(A)至离心管,剧烈涡旋使白色沉淀从离心管壁上弹开;
7) 短暂离心10,000 g 5 min 后,去除残留溶液;
8) 加入1500 μl 包含糖原的洗涤溶液(B)至离心管并涡旋,短暂离心10,000 g 5 min 后吸取上清液,剩余的白色沉淀包括DNA 和糖原载体;
9) 加入分析用缓冲液(Zero Calibrator buffer) 使白色沉淀溶解,用于后续的DNA 分析。
注意事项:
请于各步骤使用搅拌器将溶液搅拌均匀。样品溶液里含有DNA 酶时,进行步骤2 之前请先进
行步骤3。步骤4 里样品溶解不完全时,请把保温温度升至40 - 60℃帮助溶解。但是含有部分蛋白(γ-
球蛋白)或高浓度蛋白的样品(> 50 mg/ml),加热可能会导致蛋白聚集,请注意。
* 为Molecμlar Devices 公司注册商标,是使用生物传感器的高灵敏度分析装置。
参考文献
1. Ishizawa, M., Kobayashi, Y., Miyamura, T. and Matuura,: Simple Procedure of DNA isolation from human seru
Nucleic Acids Res., 19, 5792 (1991)
DNA Extractor® Kit 问题集
Q1:产品的特色是什么?
A1:传统的方式是采用蛋白酶-SDS 的方法提取DNA,虽然能够获得高品质的DNA,但是后续需要用苯酚- 氯仿进行处理,而苯酚- 氯仿属于危险化学品,对人体有一定危害。Wako 的该试剂盒采用碘化钠法,能获得高质量和高回收率的DNA,抽提过程不需要使用苯酚-氯仿。碘化钠代替苯酚- 氯仿,溶解蛋白和脂类。糖原作为载体,异丙醇沉淀DNA。只需将试剂加入离心管内即可,不同于其他的DNA 抽提试剂盒采用柱吸附法。
Q2:测定原理
A2:碘化钠是离液序列离子的代表化合物,可作为蛋白质的溶解剂使用。月桂基酰基氨酸钠是和SDS 相同的表面活性剂,蛋白质的改性剂。由这两个化合物作用使蛋白质改性后与核酸分离。蛋白质的改性、溶解(核酸也是溶解状态)的状态中添加酒精(异丙醇),使核酸析出,沉淀。
Q3:产品说明书中的方法1 是血清中提取DNA,请问血浆是否可用?
A3:血浆可以用。
Q4:产品回收率多少?
A4:一般,样品中提取残留DNA,即使极微量(DNA 在10 pg 左右)也能高效率的回收而不伤害样品。文献* 报道的回收率是80% ~ 90%
Q5:该产品说明书上提供了两种方法,该如何选择?
A5:方法 1 是用于血清DNA 的抽提,如果样品蛋白浓度高可以采用这种方法。
方法 2 是Threshold Systems 总DNA 检测时样品的处理,是配套Molecμlar Devices 的生物制品中定量DNA 和蛋白的光寻导电位传感器(LAPS)使用。在其说明书上有介绍Wako 该款试剂盒的操作步骤。如果样品蛋白浓度低,也可以采用方法2。Molecμlar Devices 说明书上的步骤,和Wako 该款试剂盒的操作步骤略有差异,客户可依据具体情况而定。
Q6:什么样的样品可使用该款试剂盒?
A6:检测生物蛋白类药物包括抗体,疫苗和治疗性蛋白中残留的DNA。这些生物制药可能是由细菌,酵母,动物或者细胞系生产获得。残留的宿主细胞DNA 即使是小剂量,也会引起药物安全性问题,所以FDA 和WHO 对生物蛋白类药物中残留的宿主DNA 都有规定。
Q7:是否可以用蛋白酶K(Proteinase K)裂解细胞?
A7:推荐用蛋白酶K 先处理样品,可提高回收率。Protein K 本身不含有DNA。
Q8:客户使用该试剂盒前用蛋白酶K 消化样品蛋白,但是回收率没有达到文献* 提到80 ~ 90%。
A8:蛋白酶K 消化蛋白灭活核酸酶的过程可能导致纯化过程中DNA 降解。建议37 ℃(或60 ℃过夜),添加SDS 裂解缓冲液。(MD 的操作是加入蛋白酶K 和SDS 溶液,55℃过夜)
注意:PK 处理的后期SDS 浓度不能超过0.1%。在处理的末期,SDS 可能减少1/10。裂解缓冲液开始不能超过1% SDS。
Q9:是否可以用乙醇替代异丙醇?
A9:用乙醇替代异丙醇,可能会导致回收率下降。若要使用乙醇,客户可尝试自己优化条件。
Q10:按照方法2,样品的体积是400 μl 或者500 μl,如果添加蛋白酶K,样品的体积应该是多少?
A10:添加蛋白酶K 以及缓冲液的,包括蛋白酶K 和缓冲液在内样品的体积是400 μl 或者500 μl。 |