产品推荐

       在工业生产的疫苗和治疗用生物制品 (干扰素、白细胞介素、单克隆抗体、重组蛋白)中,宿主细胞残余DNA 污染直接影响最终产品和整个生产过程的质量和产量,可能引起动物致瘤、感染病毒DNA 等 严重后果, 中国药典、WHO、EU、FDA 对宿主细胞DNA 残留限量都有规定。传统 的DNA 提取方法蛋白酶K-SDS 法在SDS 的稳定和促进下降解细胞中的蛋白质特别 是核酶,再经有机溶剂萃取得到高质量的 DNA,但有提取时间较长和使用有毒溶剂 氯仿和苯酚等缺点。该产品是血清中病毒DNA 和生物制品宿主细胞残余DNA 的提取试剂盒。使用新型提 取步骤,用碘化钠(NaI)作为促溶剂,稳定且灵敏度高、时间短,无有毒溶剂,无需复杂和费力操作,即 可从样品中得到高质量和高回收率的DNA。
DNA Extractor® Kit 说明书 No.295-50201
       本产品是血清中含有的病毒DNA 和生物制品宿主细胞残余DNA 的提取试剂盒, 无有毒溶剂、 提取时间短、DNA 提取纯度高、DNA 回收率高。

■ DNA 抽提原理
       高浓度的促溶剂碘化钠和阴离子去垢剂参与生物制品中蛋白质和脂质的溶解,然后在混合物中加入异丙醇,糖原和核酸共沉淀可作为载体,而碘化钠和阴离子去垢剂阻止样品中蛋白等成分的沉淀使其溶于液相,从而选择性沉淀DNA。

■ 试剂
1.试剂盒组分:
      1)碘化钠溶液
      2)月桂酰肌氨酸钠
      3)洗涤溶液(A)
      4)洗涤溶液(B)
      5)糖原溶液

1 x 26 ml
1 x 1.2 ml
1 x 42 ml
2 x 40 ml
1 x 0.1 ml
2.必需的试剂和仪器:
试剂: 1)异丙醇(特级) 40 ml
            2)蒸馏去离子水 6 ml
仪器: 1)微型离心机(Max. 12,000 g)
            2)有盖微量离心管(1.5 or 2 ml)
            3)旋涡混合器

■ 保存
       2 - 10℃,试剂盒的保存期为2 - 3 年。
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DNA Extractor® Kit 实验方案
■ 方案1:血清中DNA 提取操作步骤
试剂准备:
1) DNA 提取之前,试剂提取如下:
       26 ml 碘化钠溶液加入6 ml 蒸馏去离子水稀释,
       再加入1 ml 月桂酰肌氨酸钠和65 μl 糖原溶液并混合均匀。
2) 向洗涤溶液(B)加入2 μl 糖原溶液并立即混合均匀。

注意事项:
1) 用于稀释Nal 溶液的蒸馏去离子水须去除DNA。
2) 配制好的洗涤溶液(B)在4℃至少能保存一周。如果需要少量的洗涤溶液(B),加入糖原
溶液到无菌离心管中至合适体积即可。
3) 在保存期间Nal 溶液会结晶,加热溶液至50℃可帮助溶解。

DNA 提取步骤:
1) 吸取100 μl 的血清样品加入1.5 ml 微量离心管;
2) 再加入300 μl 配制好的Nal 溶液至离心管并混合均匀;
3) 将离心管在60℃恒温容器中加热15 分钟;
4) 取出离心管,加入400 μl 异丙醇至离心管并混合均匀;
5) 离心管在室温静置15 分钟后离心10,000 g 15 分钟;
6) 尽可能多地吸取上清液,将离心管倒置在纸面上除去残留溶液;
7) 加入1 ml 配制好的洗涤溶液(B)重悬浮得到的白色沉淀,并使白色沉淀从离心管壁上弹开;
8) 短暂离心10,000 g 5 min,去除上清液,将剩余沉淀真空干燥,用于后续的DNA 分析。

■ 方案2: Threshold* 系统DNA 定量法的预处理

试剂预处理:
1) 将65 μl 糖原溶液加入26 ml 碘化钠溶液;
2) 将2 μl 糖原溶液加入40 ml 洗涤溶液(B),立即混合均匀。

注意事项:
1) 用于稀释碘化钠溶液的蒸馏去离子水须去除DNA。
2) 配制好的洗涤溶液(B)在4℃至少能保存一周。如果需要少量的洗涤溶液(B),加入糖原 溶液到无菌离心管中至合适体积即可。
3) 在保存期间碘化钠溶液会结晶,加热溶液至50℃可帮助溶解。
4) 提取步骤应在DNA 变性之前,因此重要的是使用无菌技术尽可能降低DNA 污染。预先包装好的无菌吸管、无菌试管和手套都要经过此步骤。

DNA 提取步骤:
1) 吸取400 μl 或500 μl 的样品加入2 ml 无菌带盖微量离心管并混合均匀;
2) 吸取20 μl 的月桂酰肌氨酸钠溶液加入微量离心管并混合均匀;
3) 再加入500 μl 包含糖原的碘化钠溶液至混合溶液,涡旋后在40℃保温15 分钟;
4) 加入900 μl 异丙醇至混合溶液,涡旋后静置于室温15 分钟;
5) 短暂离心10,000 g 15 min 后,能看见管壁有白色沉淀,吸取上清液后将离心管倒置于纸面去除残留溶液;
6) 加入800 μl 洗涤溶液(A)至离心管,剧烈涡旋使白色沉淀从离心管壁上弹开;
7) 短暂离心10,000 g 5 min 后,去除残留溶液;
8) 加入1500 μl 包含糖原的洗涤溶液(B)至离心管并涡旋,短暂离心10,000 g 5 min 后吸取上清液,剩余的白色沉淀包括DNA 和糖原载体;
9) 加入分析用缓冲液(Zero Calibrator buffer) 使白色沉淀溶解,用于后续的DNA 分析。

注意事项:
       请于各步骤使用搅拌器将溶液搅拌均匀。样品溶液里含有DNA 酶时,进行步骤2 之前请先进 行步骤3。步骤4 里样品溶解不完全时,请把保温温度升至40 - 60℃帮助溶解。但是含有部分蛋白(γ- 球蛋白)或高浓度蛋白的样品(> 50 mg/ml),加热可能会导致蛋白聚集,请注意。

* 为Molecμlar Devices 公司注册商标,是使用生物传感器的高灵敏度分析装置。

参考文献
1. Ishizawa, M., Kobayashi, Y., Miyamura, T. and Matuura,: Simple Procedure of DNA isolation from human seru
Nucleic Acids Res., 19, 5792 (1991)

DNA Extractor® Kit 问题集
Q1:产品的特色是什么?
A1:传统的方式是采用蛋白酶-SDS 的方法提取DNA,虽然能够获得高品质的DNA,但是后续需要用苯酚- 氯仿进行处理,而苯酚- 氯仿属于危险化学品,对人体有一定危害。Wako 的该试剂盒采用碘化钠法,能获得高质量和高回收率的DNA,抽提过程不需要使用苯酚-氯仿。碘化钠代替苯酚- 氯仿,溶解蛋白和脂类。糖原作为载体,异丙醇沉淀DNA。只需将试剂加入离心管内即可,不同于其他的DNA 抽提试剂盒采用柱吸附法。

Q2:测定原理
A2:碘化钠是离液序列离子的代表化合物,可作为蛋白质的溶解剂使用。月桂基酰基氨酸钠是和SDS 相同的表面活性剂,蛋白质的改性剂。由这两个化合物作用使蛋白质改性后与核酸分离。蛋白质的改性、溶解(核酸也是溶解状态)的状态中添加酒精(异丙醇),使核酸析出,沉淀。

Q3:产品说明书中的方法1 是血清中提取DNA,请问血浆是否可用?
A3:血浆可以用。

Q4:产品回收率多少?
A4:一般,样品中提取残留DNA,即使极微量(DNA 在10 pg 左右)也能高效率的回收而不伤害样品。文献* 报道的回收率是80% ~ 90%

Q5:该产品说明书上提供了两种方法,该如何选择?
A5:方法 1 是用于血清DNA 的抽提,如果样品蛋白浓度高可以采用这种方法。
         方法 2 是Threshold Systems 总DNA 检测时样品的处理,是配套Molecμlar Devices 的生物制品中定量DNA 和蛋白的光寻导电位传感器(LAPS)使用。在其说明书上有介绍Wako 该款试剂盒的操作步骤。如果样品蛋白浓度低,也可以采用方法2。Molecμlar Devices 说明书上的步骤,和Wako 该款试剂盒的操作步骤略有差异,客户可依据具体情况而定。

Q6:什么样的样品可使用该款试剂盒?
A6:检测生物蛋白类药物包括抗体,疫苗和治疗性蛋白中残留的DNA。这些生物制药可能是由细菌,酵母,动物或者细胞系生产获得。残留的宿主细胞DNA 即使是小剂量,也会引起药物安全性问题,所以FDA 和WHO 对生物蛋白类药物中残留的宿主DNA 都有规定。

Q7:是否可以用蛋白酶K(Proteinase K)裂解细胞?
A7:推荐用蛋白酶K 先处理样品,可提高回收率。Protein K 本身不含有DNA。

Q8:客户使用该试剂盒前用蛋白酶K 消化样品蛋白,但是回收率没有达到文献* 提到80 ~ 90%。
A8:蛋白酶K 消化蛋白灭活核酸酶的过程可能导致纯化过程中DNA 降解。建议37 ℃(或60 ℃过夜),添加SDS 裂解缓冲液。(MD 的操作是加入蛋白酶K 和SDS 溶液,55℃过夜)
注意:PK 处理的后期SDS 浓度不能超过0.1%。在处理的末期,SDS 可能减少1/10。裂解缓冲液开始不能超过1% SDS。

Q9:是否可以用乙醇替代异丙醇?
A9:用乙醇替代异丙醇,可能会导致回收率下降。若要使用乙醇,客户可尝试自己优化条件。

Q10:按照方法2,样品的体积是400 μl 或者500 μl,如果添加蛋白酶K,样品的体积应该是多少?
A10:添加蛋白酶K 以及缓冲液的,包括蛋白酶K 和缓冲液在内样品的体积是400 μl 或者500 μl。
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Wako DNA 提取试剂盒产品选择


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