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| 预防支原体：影响最严重、传播最广泛、最具毁灭性的细胞培养污染源 任何处理的细胞培养都存在着微生物污染的风险。细菌和真菌造成的污染比较容易检测、预防以及去除, 然而支原体造成的污染不论是在发生率、检测、预防还是去除上都更为困难。 有超过20种不同类型的支原体从细胞培养物中被分离出来, 但是最常见的, 占到分离品种80-90%的主要是M.arginini, M.fermentans, M.hyorhinis, M.orale和Acholeplasma laidlawii. |
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| 为什么支原体污染率如此之高？ | ||||||||||||||||||||
| 1. 最小的自我复制的微生物(直径0.2~2μm)。由于这个原因, 即使培养基和血清过滤灭菌,支原体也可以轻松通过滤膜, 于是在常规给养的过程中意外的被引入到培养系统中, 导致培养细胞浓度低。 2. 支原体没有刚性的细胞壁, 通常使用的抗生素例如青霉素和链霉素均是作用于微生物的细胞壁, 因此对支原体没有效果。 3. 由于支原体体积小并且没有细胞壁, 就造成了他们在细胞培养过程中即使生长密度非常高(普遍为107~109 CFU/ml), 也没有任何明显的可见的污染迹象—没有混浊、PH变化甚至细胞病变。显微镜观察培养的活细胞也无法检测到支原体的存在。 |
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| 支原体污染的后果？ | ||||||||||||||||||||
| 1. 细胞培养中副作用：改变生长特点、细胞膜组成、染色体结构等等。 2. 不准确或者错误的实验结果。 3. 珍贵培养细胞的损失。 因此, 定期进行支原体检测, 确保无支原体的细胞培养体系, 最终才能获得高质量的、有效的实验数据。 现MP Biomedicals隆重推荐高效的支原体“检测”和“去除”系列产品，如下：
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支原体去除试剂
-MYCOPLASMA REMOVAL AGENT（MRA） |
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| MP Biomedicals的MYCOPLASMA REMOVAL AGENT（MRA）被European Collection of Animal Cell Cultures (Porton Down, U.K.) 认为是去除支原体最有效的产品。 | ||||||||||||||||||||
MRA提供的浓度是即拆即用型, 室温保存, 每瓶MRA含有5ml 4-oxo-quinoline-3-carboxylic acid衍生物 (浓度：50 μg/ml)。 |
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References 1. Shubhra Singh & S. K. Puri & Kumkum Srivastava. Treatment and control of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum culture. Parasitol Res104:181–184, (2008). 2. O'Dea K.P., Pasvol G.: Optimal tumor necrosis factor induction by Plasmodium falciparum requires the highly localized release of parasite products. Infect. Immun., 71: 3155- 3164, (2003) 3. Rowe J.A., Scragg I.G., Kwiakowski D., Ferguson D.J.P., Carucci D.J., Newbold C.I. Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication. Mol. Biochem. Parasitol., 92 : 177-180, (1998) 4. Peppel K., Jacobson A., Huang X., Murray J.P., Oppermann M., Freedman N.J. Overexpression of G protein-coupled receptor kinase-2 in smooth muscle cells atte-nuates mitogenic signaling via G protein-coupled and platelet-derived growth factor receptors Circulation, 102 : 793-799, (2000) 5. Trucco C., Javier Oliver F., De Murcia G., Menissier-de-Murcia J.: DNA repair defect in poly(ADP-ribose) polymerase-deficient cell lines. Nucleic Acid Res., 26 : 2644-2649, (1998). |
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支原体检测试剂盒
-IMMUMARK™ MYCOTEST™ (免疫荧光检测法) |
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ImmuMark™ MycoTest™ 试剂盒是一款运用免疫荧光方法检测培养细胞中支原体污染的产品。该产品中使用的单抗CCM-2特异性针对最流行支原体株系中(包括Acholeplasma laidlawii, M. bovis M. hominis, M. hyorhinis, M. arginini, M.
orale, M. fermentans, M. pulmonis, M. hyopneumoniae和M. salivarium等)的共同抗原。ImmuMark™ MycoTest™ 试剂盒提供两种检测方法。
直接法或间接法孵育样品后, 用PBS冲洗掉多余试剂, 在荧光显微镜下观察结果(最大激发波长490nm, 平均发射波长 520nm, 放大倍率400~600X)。 结果 在感染细胞的边缘或在细胞之间可以观察到黄-绿荧光, 感染细胞呈现明亮的红色。在多数情况下, 支原体都是在细胞表面的一点密集排列。 |
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支原体染色试剂盒
-Mycoplasma Stain Kit |
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 培养细胞中的细菌污染、酵母污染或霉菌污染都在光学显微镜下可见, 但支原体污染在光学显微镜下不可见, 必须通过特定的检测方法进行检测。 鉴别和确定支原体污染, 已知的方法有直接培养法, 支原体特异酶检测, RNA标记法, 放射自显影法, PCR技术以及DNA 荧光染色法。上述检测方法中, 除DNA荧光染色法检测外, 都需要较长的时间以及多种实验设备及试剂支持, 操作步骤 也比较烦琐。 DNA荧光染色检测法的优点是既灵敏, 又非常快速。有几种DNA荧光染料如DAPI、氮芥喹吖因、二盐酸喹吖因等, 但它 们都不如Hoechst的荧光染色效果好。Hoechst染料的特点是缓慢淬火和最低的本底荧光。 MP Biomedicals的支原体染色试剂盒(Mycoplasma Stain Kit)用于在培养细胞中原位染色检测支原体或其它原核生物。该试剂盒的原理是DNA荧光染色检测法, 采用的荧光染料为Hoechst 33258。Hoechst染色后在荧光显微镜下观察结果 , 污染的类型可以根据其形态、大小以及其与培养的细胞的相互关系来确定。荧光显微镜下, 支原体是存在于胞质中的大小均一的荧光小点或短棒(丝状物), 而其他污染物的体积则会更大一些并且荧光更亮。 结果 样本应该在荧光显微镜下以400~1000X油镜镜头观察(激发波长：360nm；发射波长：490~500nm)。通过阳性和阴性对照玻片与结果的比较, 可以很容易的辨认出支原体。 未污染培养 在未被污染的培养物中只有细胞核被染色, 偶尔会出现从死细胞或破损细胞中释放的呈球形的微核或其他的核碎片,它们与支原体相比, 体积更大并且荧光更亮。 污染的培养 被污染的培养中可以观察到细胞核被许多荧光小亮点包围着, 他们的直径普遍在0.1~0.3μm之间并且具有多形性, 形态可以从球形一直到细丝状。 |
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