定制的肽核酸可以标记或不标记染料及其它化学物质，它们也可以和多肽偶联以增加其功能。标记时，接头(linkers)不仅可以起到空间间隔(spacer)的作用，还能改善其溶解性。Gamma PNA或者修饰的碱基可以更进一步提高肽核酸的解链温度Tm和特异性。

关于肽核酸

肽核酸 (Peptide Nucleic Acid，PNA)  是一种人工合成的类似于 DNA 或 RNA的聚合物。与多肽类似，各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基连接到主链骨架上。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高。不易被DNA酶和蛋白酶水解，PNA在体内以及体外极其稳定。

PNA的主要应用

·  序列特异性的PCR抑制剂（PNA夹）

·  端粒、着丝粒FISH探针，基因特异性探针，感染试验

·  反义/抗微生物试剂

·  miRNA抑制剂

·  双链DNA侵入和捕获

·  微阵列探针

由于其高亲和力和特异性，PNA能有效结合靶核酸。未标记的PNA通常作为基因的PCR反应的特异性阻断剂（PNA夹）。这种技术可以有效地检测靶基因中的SNP突变。

PNA倾向于定向且逆平行结合到靶核酸。PNA 5' 端的氨基（也写为 5' 或 H-），可以结合其它功能基团，PNA 3' 端的酰胺基（也写为-NH2或3'）反应活性弱。5' 端乙酰化可以阻止其继续发生反应。

因为PNA的解链温度Tm 高于DNA，一般情况下，大部分使用的PNA的长度为10 - 21个碱基。PNA链越长，溶解性越差。嘌呤含量高（＞60%）尤其是碱基G，是导致溶解性差的原因。根据序列，PNA链最大长度约为40个碱基。然而，我们强烈建议检查Tm，设计探针应具有适当的长度和序列。

当PNA链较长（>22mer）或者嘌呤含量高（＞60%）时，为了提高PNA探针的溶解性，我们建议在序列中加入一些助溶基团如O linker、E linker、X linker或者两个赖氨酸。当PNA偶联多肽或染料时，接头(linker)可以起到空间间隔(spacer)的作用。

·  可能用到的接头

   - O linker (也称 AEEA 或 eg1)：常用来提高溶解性

   - 起到空间间隔作用：O、E、X、C3、C4、C6、C12

   - 加入巯基：C6SH、C11SH

PNA链5’端和3’端均可以标记。由于3' 端是非活性基团(-CONH2)，所以需加入一个赖氨酸，其侧链上的氨基可以用来标记。

如果在5' 端标记，我们建议在PNA 和标记物之间加 1-2 O linkers。

标记物：荧光基团（—NHS酯或羧基酰胺）、生物素、棕榈酸、地高辛、DABCYL、叠氮化物、亚甲基蓝、巯基等。

<常见的荧光标记>

因为肽核酸主链是基于多聚酰胺连接在一起，肽核酸可以很容易地与多肽结合以增加功能。例如，加入赖氨酸可提高肽核酸的溶解性；加入半胱氨酸可使肽核酸与其它分子通过二硫键连接在一起。

PNA链两端均可以用来偶联多肽，但经常偶联在5' 端（肽+ PNA）。多肽和PNA之间需加入起到空间间隔作用的O linker。

肽核酸-多肽一个最普遍的应用就是用作抗微生物试剂，它是由CPP[最常见的（KFF）3K或（RXR）4xB]和含有10 - 15碱基的PNA分子组成，对微生物必需的基因具有反义作用。

同样，在哺乳动物细胞中，使用CPP-PNA（设计的PNA对靶mRNA反义）可以很容易地建立反义寡核苷酸的方法。最常见的是，PNA设计在5' ATG 和上游区域。

多肽-PNA另一种应用是基因芯片，可以从目标微生物中捕获反基因和转录基因。

一般来说，肽核酸-多肽是在树脂上从C端到N端连续合成的。

Gamma PNA在N-aminoethylglycine单元的gamma位C原子上具有手性中心。Gamma取代可在普通PNA每第三个残基处。

每增加一个gamma取代，其 Tm就会提高5 - 8℃，可导致更高亲和力的序列特异性结合。此外，gamma PNA可以插入双链DNA中，形成三螺旋结构。

此外，gamma PNA还有这样几个优点： 增加溶解性、不发生自凝聚、PNA-DNA结合更稳定和标记多样性及其他功能。

  合适的gamma功能基团

-赖氨酸：较好溶解性、两端可双标、细胞渗透。
 - MiniPEG：更好溶解性和特异性结合、有效的插入双链DNA中。
 - 丙氨酸和谷氨酸也可以修饰。

PNA低聚物可以在任一方向形成双链，但反平行方向优先。

PNA / DNA的Tm一般比相应的DNA / DNA高。粗略地说，每一个碱基对可增加大约1℃。

由于和互补DNA 序列高亲和性，通常不需要设计长链的PNA。最常见的PNA含有12-21个碱基。

强烈建议避免任何自我互补序列，如反向重复序列，发夹和回文序列，这是因为PNA / PNA相互作用强于PNA / DNA。

同样建议避免嘌呤含量高的序列，因为它们往往发生聚合，导致水溶性差。尽量使嘌呤含量低于60%。也尽量避免相邻嘌呤超过6个残基，特别是连续4个或更多的G残基。

为了提高PNA探针的溶解性，可在序列中加入一些助溶基团如O linker、E linker、X linker或者两个赖氨酸。