瞒不住了！高通量单细胞RNA-Seq，长读长的那种！

在有些研究场景下，长读长测序（long-read sequencing）方法相比传统的短读长测序（short-read sequencing）方法，会是一个更好的选择。长读长测序文库构建操作相对简便。需要多次重复构建文库时，长读长测序也不需面对短读长测序那样复杂繁琐的操作流程。此外，长读长测序建库过程中，转录本cDNA不会被打断，测序数据分析时无需reads拼接步骤，直接检测转录本全长信息。因此，对于一些融合事件、异构体，以及其它结构变异的检测能力得到提升。

本次推送为大家献上一份ICELL8 cx单细胞分选系统用户可以参考的《单细胞长读长测序建库方案》。

在该建库方案中，以单细胞起始，通过ICELL8 3'DE引物和5' SMART引物来合成cDNA及扩增。反转录酶首先以Oligo d(T)为引物，mRNA为模板，合成cDNA。合成进行至mRNA模板5’末端时，5’SMART引物会作为新的模板，让反转录反应继续进行。这样就可以获得两端带有接头的转录本全长cDNA。熟悉SMART技术的您已经知道了，这是一个模板转换的过程。获得单细胞转录本的全长cDNA后，由ICELL8 3'DE引物对cDNA进行扩增。以上过程通过一个RT-PCR步骤直接完成。

cDNA扩增任务完成后，开始接头序列的连接。首先，通过一次PCR将ONT接头连接到cDNA产物的两端。然后，由第二次PCR将修饰的ONT Whole Genome Primer（WGP)连接到的cDNA产物上。最后，加入Rapid Adapter进行连接，即完成建库流程。
连接好接头后，即可在ONT测序平台上进行测序。完整的流程示意图送给大家。

建库流程可看成两个部分：
 01 
单细胞分选，合成cDNA，并连接ONT接头。
ICELL8 cx系统利用微泵微阀装置，配合微孔芯片完成单细胞的分选，通过荧光成像系统记录下获得单个细胞微孔的位置信息，并在微孔芯片中进一步完成单细胞cDNA的合成与扩增。
芯片微孔中已预先固相化了连接有条码标签序列的Oligo d(T)引物，来自同一个单细胞的mRNA合成cDNA后将连接上相同的条码标签。

我们用K562细胞进行了一个测试，看看这一部分结束后收获的cDNA文库情况如何：

 02 
cDNA产物连接ONT Whole Genome Primer。
在这一步，取01中获得cDNA产物 2ng，加入到反应试剂中，进行一步PCR反应。

我们再看一看添加好ONT WGP之后，测序文库的情况如何：

上机测序前，还需要经过简单的操作，连接好Rapid Adapter。
以上就是ICELL8 cx单细胞分选系统与ONT联袂奉献的精彩建库表演。

但是…我们的方案还没结束！ 单细胞测序怎么少得了…数据处理！
一套ICELL8-ONT分析流程专门用于分析该文库的下机测序数据。该分析流程由5个分析脚本（script）组成，完成对原始FASTQ文件的处理。得到的结果可以用于下游的各种数据可视化分析。

关于该方案的全部信息，我们已经整理了一份完整的材料供大家了解学习。填写文末信息，领取完整材料！

使用二代测序，基于Illumina测序平台的高通量单细胞全长转录组建库方法也在最近的推送中进行了介绍。点击《单细胞全长转录×靶向富集》可以再次阅读了解。

关于ICELL8 cx单细胞分选系统，我们在《Takara高通量单细胞分选系统——助力心血管疾病研究》这一期推送中进行了更详细的介绍。点击题目可以再次阅读了解。

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