石蜡包埋技术诞生已有百年之久，FFPE样本是医学领域尤其是肿瘤研究领域中疾病诊断和科学研究中非常常见且宝贵的生物学材料，近年来二代测序的飞速发展也将FFPE样本的信息挖掘提升到了前所未有的高度。然而在FFPE样本的制备过程中，福尔马林固定使得组织中的DNA之间、DNA与蛋白质、RNA等发生随机交联并使得DNA降解，石蜡包埋过程又加速了DNA降解，给下游的PCR及高通量测序带来很大挑战。如何从FFPE样本中获得高品质的核酸来满足下游检测十分重要。

QIAGEN在FFPE样本DNA纯化方面积累了丰富经验，QIAamp DNA FFPE Kit及GeneRead DNA FFPE Kit等产品受到了科学研究者的广泛好评。现在，我们在这两款试剂盒的基础上进一步升级，QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit使得FFPE样本DNA纯化效率更高，片段化程度更低！请随小编一起了解FFPE样本DNA纯化流程的注意事项和QIAGEN的解决方案。 各试剂盒的具体处理方法有所差异，通常来说，FFPE样本的提取包括脱蜡和水化、酶消化组织、逆转交联，组织DNA提取几个步骤。

石蜡包埋会阻碍消化液对组织的渗透，减弱蛋白酶K与组织接触，影响组织消化，降低DNA得率，所以脱蜡一定要彻底！大家所熟知的有机溶剂二甲苯便是一种脱蜡液，但是二甲苯处理不仅会进一步加剧核酸片段化，切片厚度增加也会使得脱蜡效果变差，而且对人体有害。QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit中使用的是非有机试剂Deparaffinization Solution进行脱蜡，对人体无害，更能保证核酸的完整性，这对于大片段的扩增非常关键。有必要指出的是QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit只需要一片切片组织，就能纯化到0.5ug的DNA，足以进行下游的NGS实验。当然这款试剂盒也能处理多可达4mm ³ 组织，即面积100mm ² ，厚度8μm的5张切片。

为了将DNA与结合的蛋白质分离，FFPE样本需要蛋白酶K消化。蛋白酶K可以消化蛋白质组分以及样品中可能存在的任何核酸酶，这个步骤还可防止DNA发生降解。消化的时间过短，DNA的释放不充分，导致核酸提取的得率低。QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit采用两次蛋白酶K处理，分别是脱蜡后56℃孵育1h和逆转交联之后65℃处理15min，可进一步提高核酸释放率，即使是难裂解的组织样本也不在话下！

如前述，FFPE样本在制备过程中会发生不同程度的分子间交联，这些交联必须断裂才能释放出DNA用于后续分析。逆转交联需尽量在温和的环境中进行以避免DNA的进一步破坏。在此步骤中，最重要的是做好逆转交联和DNA片段化的平衡。DNA的完整性对于FFPE来源的样本非常重要，QIAGEN推荐在90℃条件下孵育1h，可实现基因组DNA的最佳回收。如下图所示，在不同组织类型中检测相同样本66bp或500bp的DNA片段，使用QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit纯化所得的Ct值更低，表明核酸完整性更高，且在不同组织中的表现相对更稳定。

由于FFPE样本储存时间的延长， 样本中存在由于脱氨基导致的C>U的改变，经过PCR或NGS文库构建后使得C-G突变为T-A，这类突变在基因组中随机发生，且在同一位点上的突变丰度较低，如未经有效清除这些人为干扰，在基因测序尤其是二代测序数据分析时有可能被解读为与疾病的发生发展相关的变异，产生假阳性，因此很有必要在这些低丰度突变中区分真实突变与人为突变。

QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit含有UNG酶，在加热解交联后，通过去除脱氨基胞嘧啶残基，特异性地从FFPE样品获得的DNA中去除人为假突变产生的尿嘧啶，可消除90%以上的低丰度突变，使假阳性风险降至最低。

QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit去除超过90%的低丰度变异，这些变异多为（保存过程中）自发的人为干扰

QIAamp DNA FFPE Advanced UNG Kit采用UCP MinElute硅胶膜离心柱进行纯化，UCP (Ultra Clean Production) 超洁净生产工艺生产，充分降低试剂生产过程中的污染对实验结果的影响。最低20μl洗脱体积，是微量FFPE样本纯化的又一大福音！

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