全基因组功能基因筛选，Takara轻松解决！

利用CRISPR/Cas9技术建立目标物种的全基因组敲除库或与特定功能相关的基因敲除库，通过功能性筛选和富集及后续PCR扩增和深度测序分析，发掘与筛选表型相关的基因，称为sgRNA文库筛选。合理、高效的sgRNA文库设计是进行基因组/代谢通路编辑的重要前提，sgRNA文库结合高通量筛选技术在药物研发、基因功能研究、分子诊断、疾病治疗和作物育种等领域均发挥重要的作用（Chen et al., 2016）。

Takara Guide-it™ CRISPR全基因组sgRNA文库系统，可对约19,000个基因进行有效筛选！该文库系统使用CRISPR/Cas9，在人源细胞中轻松实现全基因组表型敲除筛选。Lenti-X Single Shots包含了全基因组sgRNA文库和Cas9表达系统，可方便制备出稳定表达Cas9和sgRNA文库的筛选用细胞系。

系统特点

★  利用CRISPR / Cas9基因敲除，对相关基因进行全基因组筛选
★  相较于芯片文库，混合文库对于基因组的基因筛选操作简单、成本更低
★  共计76,000个sgRNA，可靶向约19,000个基因，有效降低脱靶效率
★  Cas9和sgRNA的导入使用慢病毒系统*，可高效导入广泛细胞类型
★  ALL-IN-ONE型试剂盒，包含全套慢病毒制备所需试剂，使用方便

*本品所制备慢病毒为SIN型（self inactivating），可在生物安全防护二级实验室条件下使用。用于导入sgRNA的重组慢病毒包含荧光蛋白mCherry基因。

一图轻松Get筛选流程

通常来说，文库系统可根据实验制定阳性筛选或阴性筛选两种实验方案。
阳性筛选可以识别出对筛选条件敏感的基因，一旦相关基因被敲除细胞就可以在筛选中存活。在这类筛选中，大多数细胞会死亡，只有表达靶向敏感基因sgRNA的细胞才能存活。
阴性筛选则是确定了在筛选条件压力下生存所必需的基因。在应用筛选条件后，表达相关基因sgRNA的细胞出现抗筛选基因功能缺失，从而导致其他sgRNA在细胞中过度表达并出现富集。

经典实验案例：使用sgRNA文库进行6-硫鸟嘌呤（6-TG）耐药性基因筛选

图A. 将慢病毒转导后经6-TG筛选细胞群、慢病毒转导后未经6-TG筛选细胞群以及原始质粒文库*细胞群分别分离出sgRNA，并进行测序及比较分析。靶向HPRT（红色）和NUDT5（黑色）的四种sgRNA均在6-TG筛选的细胞群（蓝色）中出现富集表达。图中灰色表示原始质粒文库中sgRNA的表达，橙色表示未经6-TG筛选的细胞群中sgRNA的表达。
图B. 蓝色表示经6-TG筛选后sgRNA发生的变化。图中红色和橙色代表在相关性分析中，被富集的sgRNA被重点标注出。插图为与未经筛选的细胞相比，在筛选后的细胞中作用于HPRT的4条sgRNAs的富集倍数。

*原始质粒文库指构建在慢病毒载体上的sgRNA文库，实验表明CRISPR全基因组sgRNA文库系统能够在目标细胞群体的转导和选择过程中保持sgRNA的代表性。

参考文献：
Chen C, Sha H, Yang B, et al. Establishment and optimization of genome-wide CRISPR/Cas9-sgRNA screening system in THP1 cell line for functional oncogenes and tumor suppressor genes[J]. Scientia Sinica(Vitae), 2016.

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