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qPCR技术介绍（三）——PCR反应 |
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1. PCR引物/探针的设计原则 |
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| 引物设计的优劣，是影响定量PCR实验结果的重要因素之一。有些引物反应性能差，可以通过反应条件优化得到改善，但大多数情况改善效果并不是很明显，所以，预先设计反应性能良好的引物尤为重要。 | ||
| qPCR引物设计原则 | ||
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| 除此之外，引物的长度、扩增片段长度以及基因组结构等参数都要加以考虑，下表总结了引物设计原则，★号表示重要程度，★号越多，表示该参数越重要，设计时要优先考虑。 | ||
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| 采用荧光探针检测法时，要同时考虑引物和探针的质量。通常首先要寻找合适的探针位置，再进行引物的设计，然后再将引物和探针之间进行比对分析，应该说设计上比采用荧光嵌合法更加困难和繁琐。下表总结了探针设计原则，★号表示重要程度，★号越多，表示该参数越重要，设计时要优先考虑。 | ||
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| 通常可以使用引物设计专用软件进行引物、探针的设计，如Primer Premier、Oligo 7等，也可以利用NCBI网站功能，无需下载软件也可进行设计，并可以进行特异性的比对。 | ||
| 如果想省去自己设计引物的繁杂操作，在Takara合成qPCR引物/探针，Takara可以免费提供引物/探针的设计服务。 | ||
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2. 预实验确认引物性能 |
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| 新设计合成的引物，首先必须进行预实验，对反应性进行确认。 模板使用梯度稀释的cDNA溶液即可，每个反应加入相当于Total RNA 1 pg、10 pg、100 pg、1 ng、10 ng、100 ng的cDNA，对PCR扩增效率、检测灵敏度、无模板对照和gDNA来源的扩增4个方面进行确认。 | ||
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| 如果预实验显示，PCR扩增效率低或有引物二聚体等非特异性扩增时，需要对PCR条件进行优化，优化可以按下图的顺序进行。 | ||
| 如果条件优化后结果仍无改善，必须重新设计引物。 | ||
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3. 一步法与两步法的选择 |
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| qPCR常用于对样本中的DNA或RNA进行定量，在对RNA进行定量的时候，需要先进行反转录反应（RT反应），将RNA反转录为cDNA。 | ||
| Two Step RT-PCR反应是将反转录反应和qPCR反应分两步进行；One Step RT-PCR的反转录反应和PCR反应在同一反应管内连续进行。 | ||
| Two Step RT-PCR反应，可选择Random Primer、Oligo dT Primer或基因的特异性引物进行反转录反应，然后再将一部分反转录反应液（cDNA）作为模板添加到Real Time PCR反应液中。使用反转录引物时可以根据实验目的选择最合适的反转录引物，如果选择Random Primer或Oligo dT Primer，合成的cDNA可用于复数种类基因的检测，cDNA溶液可以稳定地长期保存，供以后解析使用。 | ||
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| One Step RT-PCR的反转录反应和PCR反应在同一反应管内连续进行，操作简单，污染几率低。反转录反应需要使用基因特异性引物 (GSP)，即基因特异性PCR下游引物，因此，能够对特定基因进行高感度检出。 | ||
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| ► 如何选择？ | ||
| 以前，Two Step RT-PCR的反应性能占有优势，但近些年来由于对试剂盒的不断改良，One Step RT-PCR也能够实现良好的反应性能。 | ||
| 究竟采用何种方法，可根据实验目的自由选择。例如，病毒、病原菌检测，适合使用操作简单的One-Step RT-PCR方法；基因表达解析等目的基因数多时，适合使用通用引物的Two Step RT-PCR方法；样品数多时，Two Step RT-PCR的操作显得过于繁杂，而One Step RT-PCR就很方便。 | ||
| 另外，One Step RT-PCR因使用基因特异性反转录引物，Total RNA的添加量即使很多，也能够高效率反应，所以，有利于低表达基因的检出。 |
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