摘 要
    为了提高萤火虫及海肾荧光素酶对快速变化的转录活性的反应能力，我们构建了含有蛋白或蛋白与mRNA降解序列的去稳定报告体。这些Rapid Response^TM 报告体的半寿期被降低了60%以上。因而，它们反应迅速并且对转录速率的快速变化有较强的放大效果。作为结果，达到报告体表达所需的最大诱导时间下降到75%，这样可以降低由次级效应造成的假象。

前 言
    因为萤火虫及海肾荧光素酶高灵敏，使用灵活及易于定量，所以在细胞生物学及药物开发应用方面被广泛应用于监测转录活性。另外，由于荧光素酶报告体的内在稳定性相对较低（蛋白半寿期约为3小时），所以它可以快速揭示转录的动态变化。但是，报告的变化比发生的转录事件有数小时的滞后。为了更好地发挥报告体的作用。我们开发了Rapid Response^TM 报告载体以提供较好的表达动力学性能。这些载体编码去稳定萤火虫及海肾荧光素酶报告体，利用基因工程方法将蛋白或蛋白与mRNA降解序列与荧光素酶基因融合在一起得到去稳定萤火虫及海肾荧光素酶报告体。由于提高了它们的降解速度，去稳定报告体应答快速并通常表现出对快速转录事件较强的放大效果。

提高应答速度
    去稳定报告体是如何提高对快速转录事件的应答速度的？当进行报告体检测时，需要测定细胞内报告蛋白的总和。报告体地累积过程在细胞内的存活期内均可发生，这是由蛋白及mRNA的稳定性决定的。如果转录在存活期内发生变化，那么报告体的积累结果将是不同转录速度的综合的反映。存活期越长，进入报告检测的不同转录速度的集合越多。这种汇聚过程对转录动力学有衰减效应，使得难以测定转录速度的变化。 通过缩短报告体的存活期，从而减少进入每次报告检测的不同转录速度的干扰，可以解决

上述问题。报告体动力学的改善可用于上调和下调的基因表达。

    理想情况下，报告体的存活期应降低为零，以完全消除进入每次报告检测的不同转录速度的干扰。细胞内报告蛋白的积累只代表检测瞬间的转录速度。但是，非常不幸，零存活期同时也意味着零积累，因此检测不到报告体。必须有一个折中方案，因为，随着存活期的降低，可用于检测的报告体积累也必然减少。这里正是灵敏的生物发光检测的用武之地。与其它报告技术相比，荧光素酶报告体在细胞内的稳定性可以显著降低，而不会造成可检测信号的损失。因此，荧光素酶检测的高灵敏度可以大幅度改善荧光素酶报告体的动力学性能。

去稳定报告体的设计
    在开发Rapid Response^TM 报告载体过程中，我们比较了许多不同蛋白及mRNA降解序列在应答速率及信号放大方面的效果。同时也测试了这些降解序列的最佳定位（例如：N-或C-末端）。选择了两个序列，一个包含PEST蛋白降解序列（1），另一个包含一个mRNA(ARE)和两个蛋白（CL1及PEST）降解序列（2-5）。两种载体使科研人员可以根据适合实验设计的应答速率及应答信号的降低进行灵活地选择。

    PEST，是最初从小鼠鸟氨酸脱羧酶C-末端分离到的一段函40个氨基酸序列。它含有多个脯氨酸（P），谷氨酸（E），丝氨酸（S），及苏氨酸（T）残基，其旁边有带正电荷的残基如赖氨酸（K），精苏氨酸（R），或组苏氨酸（H）。最初从酵母分离到的18-个氨基酸CL1序列可以提高蛋白降解速度（2）。ARE mRNA降解序列以 Herpesvirus saimiri小核RNA的3'-端非翻译区为基础，由富含AU的重复序列（ARE）组成。ARE存在于许多早期应答基因的3‘-端非翻译区并被证明能够促进mRNA 降解（3-5）。

    为了在哺乳动物细胞中的提高表达效率，对荧光素酶报告基因及蛋白降解序列中的密码子进行了优化。