介 绍：
    RNA干扰（RNAi, RNA interference）技术利用细胞内源系统表达短干扰RNA（siRNA）分子，该分子能够抑制靶基因的表达。许多细胞生物学家现在对这项技术都很感兴趣。RNA干扰起始于RNA酶Ⅲ家族成员DICER识别双链RNA并将其切割成21－23个核苷酸片断。然后，RNA诱导沉默复合体（RISC, RNA-inducing silencing complex）以这些片断的一条链为模板切割互补的mRNA。DNA定向的RNA干扰（ddRNAi）可以实现基因抑制,在此过程中DNA载体被用来表达短发夹RNA(shRNA), 此短发夹RNA被DICER切割并参与RISC介导的RNAi通路。这样，我们就可以构建表达shRNA序列的DNA载体，进而影响细胞内的基因表达。
    在本文中，我们以天冬氨酸特异的半胱氨酸酰基蛋白酶家族成员之一caspase-3为靶基因介绍RNA干扰方法。Caspase-3在程序化细胞死亡或细胞凋亡过程中起了关键作用。凋亡前的刺激激活了caspase-3参与蛋白分解级联反应，导致细胞死亡和受损细胞的清除。通过特异性地抑制caspase-3的表达调节凋亡反应，能够帮助我们理解刺激调节凋亡反应的机制。 我们检测了克隆于psiSTRIKE™ hMGFP载体^(a-g)中的shRNA序列抑制HeLa细胞caspase-3基因表达的能力。我们用psiCHECK™-2载体^(b,c,h-k)快

速筛选能够最有效地抑制caspase-3基因表达的shRNA序列。Western印迹分析表明，最有效的caspase-3 shRNA在HeLa细胞中的表达使内源caspase-3蛋白质表达水平下降。

siRNAs的设计：
    设计RNAi实验需要考虑诸多重要因素。首先，要设计合适的siRNA序列和确定最佳的转染条件。转染条件随转染试剂、细胞类型、细胞浓度和转染DNA量的不同而变化。随着我们对RNAi机制的不断了解（1，2），选择目标序列的指标也在作相应改进。这些指标的讨论在siRNA设计工具的设计参数部分可以找到。siRNA设计工具见网站www.promega.com/sirnadesigner/。虽然选择siRNA的现有规则可以指导设计，但它们不能保证每一个被选的siRNA都能有效地降低基因表达，因此最佳靶序列需要实验验证。

抑制Caspase-3基因表达的重组psiSTRIKE™ hMGFP载体的构建：
    为了确定抑制caspase-3基因表达的适宜shRNA序列，我们针对caspase-3基因编码序列构建了八种不同的psiSTRIKE™hMGFP载体，分别表达八种不同的shRNA。这些靶序列是通过将caspase-3基因序列输入siRNA设计工具而产生的。八种19-23个核苷酸长度的shRNA序列均被设计成以“G”起始，这是psiSTRIKE™ hMGFP载体中U6启动子转录的最适起始位点。针对每个靶序列，合成两条含有shRNA序列的互补单链寡核苷酸DNA，它们经退火后形成双链插入片段。这些设计的寡核苷酸退火后能形成粘端便于与预先切割的psiSTRIKE™hMGFP载体连接。连接后，psiSTRIKE™ hMGFP载体经PstⅠ酶切鉴定含有插入片段的克隆。PstⅠ使没有插入片段的载体DNA线性化，但使有插入片段的载体DNA被切割成两个片段。siSTRIKE™ U6发夹克隆系统－hMGFP概述见图１。关于发夹寡核苷酸的设计及连接，详见siSTRIKE™ U6发夹克隆系统－hMGFP（人类）技术手册＃ＴＢ３３５和参考文献３。