膜片钳实验中关于补偿的一些思考

【字体: 时间:2009年11月25日 来源:科学网

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  进入实验室有段时间了,期间也经常看师兄师姐们做实验;注意到在记录release实验中都未做各种补偿,而且师兄也提到release不用补偿,以前自己的概念中形成全细胞模式就应该对电路进行各种补偿,为什么这里就不需要了呢?老革命遇到了新问题!查阅了一些书籍资料,结合实际操作,谈点自己的理解体会。

     进入实验室有段时间了,期间也经常看师兄师姐们做实验;注意到在记录release实验中都未做各种补偿,而且师兄也提到release不用补偿,以前自己的概念中形成全细胞模式就应该对电路进行各种补偿,为什么这里就不需要了呢?老革命遇到了新问题!查阅了一些书籍资料,结合实际操作,谈点自己的理解体会。
 
    首先,简单交代下需要补偿的“三大件”。哈,三大件!以前——手表、缝纫机、自行车,现在——房子!票子!车子!真是与时俱进!貌似跑题了,言归正传。
 
快电容(Cfast)、慢电容(Cslow)和串联电阻(Rseries,Rs)
 
Cfast主要成份是电极电容,
 
Cslow主要成份是细胞膜电容(全细胞记录模式下),
 
Rs主要是电极电阻和接触电阻(access resistance,Ra),有关这“三大件”的详细描述可参阅[1]P36-46。
 
    在全细胞记录时,这三个捣蛋鬼会对正确地记录通道电流产生负面作用,补偿目的就是消除这些影响,以使获得的电流数据反映真实的通道活动。下面就列举这些家伙们的恶作剧:
 
    Cfast、Cslow ,这哥俩性格差不多就合一起说了,电容器的一个特性就是当电容两端电压变化时,有电流流入或流出电容,就是我们常说的电容的充放电,这里,电容I = DQ/Dt,即I = CDV/Dt,当电容器两端电压稳定时:DV/Dt = 0,I = 0,这也是设计电压钳很重要的一个原理。在记录电压依赖性通道时,通常会给予步阶刺激,刺激的起始末尾会有电压的变化,这哥俩就会充放电,影响要记录的电流;在记release中,由于一直钳制在某个电位水平(静息或某个设置水平),没有电位的变化,所以这哥俩就老老实实的,不会引起麻烦。一般情况下,他们的充放电对那些激活较慢的通道来说影响不大,当通道电流还没有开放时,他们已经充放电完毕了,但是对一些激活较快的通道比如钠通道,有时电容电流会和通道电流融合在一起,这时就必须考虑补偿了。
 
    通常这兄弟俩在实验中都会被收拾的服服帖帖(补偿掉),这个老三Rs就显得事情多了,它引起的问题主要有[1]P38[2]P24-25[3]:
 
1. 膜电位对命令电压的反应延迟,这个主要还是对快速激活通道有影响;
 
2. 限制摄取电流的频带宽,如果Rs太高的话,一些高频信号会丢失,这样貌似电流幅度变小,从电路上分析Rs与膜通道电阻形成一个串联电路,那自然I是不变的,我们在记录过程中出现随着Rs升高看上去电流幅度减小主要是这个原因,我在以前记录的钾通道电流中也注意到补偿Rs前后,频率相对高的瞬时外向钾电流补偿后,电流会轻度的增加,电流图更好看一点,而延迟整流钾电流有时补偿前后变化不明显,当然如果Rs很高,膜重新融合,相当于断路,电流就记录不到了。
 
3. 这样,串联电路中的Rs主要引起电压降,这导致钳制电位的偏移,例I = 5nA,Rs = 2MW ,引起10mV的压降;在记录release中,I几十个pA,如果Rs 几十个MW,例I = 20pA,Rs = 40MW ,V drop = 0.8mV,这点影响可以忽略,因此有时也就不补偿了;并且,大多认为,一般观察药物施加前后的变化会消除掉这个因素,因此尽管有时不补偿,Rs波动太大的数据还是要舍弃;不过,我想:不补偿像是六十公斤级的一个年轻人和一个70岁的老人打拳击,尽管体重一样,但是两者内在的生理特性还是有差别,在一些实验中也许就得考虑这个因素的影响了。
 
参考文献
 
[1] 刘振伟. 实用膜片钳技术. 北京:军事医学科学出版社,2006
 
[2] Sakmann B and Neher E. Single-Channel Recording. Plenum Press, New York. 2nd Edit, 1995.
 
[3] Sherman, Shrier, and Cooper. Series Resistance Compensation for Whole-Cell Patch-Clamp Studies Using a Membrane State Estimator. Biophys J, 1999; 77; 2590–2601.
[4]  Wolfgang Walz. Patch-Clamp Analysis. Humana Press, New Jersey. 2nd Edit, 2007.
 
 
 
 
 
本文引用地址: http://www.sciencenet.cn/m/user_content.aspx?id=272930 
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