单分子测序开创甲基化的直接测定

美国Pacific Biosciences公司利用独有的单分子实时（SMRT）测序技术，跳过亚硫酸氢盐转化，直接测定了DNA的甲基化。文章发表在近期的《Nature Methods》在线版上。

　　

DNA甲基化参与了多个生物过程的调节，自然也就成了目前研究的热点。DNA甲基化检测的方法有很多种，但大多离不开亚硫酸氢盐转化。亚硫酸氢盐转化是将序列中未甲基化的胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶保持不变。这一步，操作繁琐，费钱费力，且极端的反应条件可能降解DNA。

直接检测甲基化也不是不行，目前的方法有薄层层析、HPLC、质谱等。但是还没有一种高通量方法，既能测定核酸序列，又能确定甲基化状态。如今，美国Pacific Biosciences公司做到了。他们利用独有的单分子实时（SMRT）测序技术，直接测定了DNA的甲基化。文章发表在近期的《Nature Methods》在线版上。

SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法。DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中。核苷酸的掺入被检测成荧光脉冲，依据其颜色鉴定出核苷酸。当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时，脉冲终止。SMRT测序的一般合成速率为每秒1-3个碱基。

荧光脉冲的到达时间和持续时间产生了关于聚合酶动力学的信息，从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。聚合酶动力学的测定是SMRT测序的内在组成，不会对DNA一级序列的测定有任何不良影响。各种修饰对聚合酶动力学的影响不一，从而能够将它们区分开。

研究人员使用这些动力学特征，鉴定出基因组样品中的腺嘌呤甲基化，并发现再结合circular consensus sequencing，他们能够在单碱基分辨率上鉴定出表观遗传学修饰（mA、mC和hmC）。研究人员还预计，其它的表观遗传学修饰，以及各种形式的DNA伤害，也能用这种方法检测。

不过，对于mC和hmC，可能还需要加强动力学灵敏度。这些改进可能来自优化的缓冲液条件，聚合酶突变和算法。研究人员认为，这种方法还有望测定高度重复的基因组区域的甲基化模式。

Pacific Biosciences的测序仪将在今年上市，目前该公司已经挑选了北美10个研究机构，作为第一批试用者，其中包括贝勒医学院、Broad研究院、冷泉港实验室和斯坦福大学等。该公司计划于今年晚些时候在欧洲和亚洲开展早期试用计划。（生物通 余亮）

原文摘要：

Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing

Nature Methods Published online: 9 May 2010 | doi:10.1038/nmeth.1459