单分子测序开创甲基化的直接测定

【字体: 时间:2010年05月20日 来源:生物通

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  美国Pacific Biosciences公司利用独有的单分子实时(SMRT)测序技术,跳过亚硫酸氢盐转化,直接测定了DNA的甲基化。文章发表在近期的《Nature Methods》在线版上。

  

DNA甲基化参与了多个生物过程的调节,自然也就成了目前研究的热点。DNA甲基化检测的方法有很多种,但大多离不开亚硫酸氢盐转化。亚硫酸氢盐转化是将序列中未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶保持不变。这一步,操作繁琐,费钱费力,且极端的反应条件可能降解DNA。

直接检测甲基化也不是不行,目前的方法有薄层层析、HPLC、质谱等。但是还没有一种高通量方法,既能测定核酸序列,又能确定甲基化状态。如今,美国Pacific Biosciences公司做到了。他们利用独有的单分子实时(SMRT)测序技术,直接测定了DNA的甲基化。文章发表在近期的《Nature Methods》在线版上。

SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法。DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中。核苷酸的掺入被检测成荧光脉冲,依据其颜色鉴定出核苷酸。当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时,脉冲终止。SMRT测序的一般合成速率为每秒1-3个碱基。

荧光脉冲的到达时间和持续时间产生了关于聚合酶动力学的信息,从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸,包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。聚合酶动力学的测定是SMRT测序的内在组成,不会对DNA一级序列的测定有任何不良影响。各种修饰对聚合酶动力学的影响不一,从而能够将它们区分开。

研究人员使用这些动力学特征,鉴定出基因组样品中的腺嘌呤甲基化,并发现再结合circular consensus sequencing,他们能够在单碱基分辨率上鉴定出表观遗传学修饰(mA、mC和hmC)。研究人员还预计,其它的表观遗传学修饰,以及各种形式的DNA伤害,也能用这种方法检测。

不过,对于mC和hmC,可能还需要加强动力学灵敏度。这些改进可能来自优化的缓冲液条件,聚合酶突变和算法。研究人员认为,这种方法还有望测定高度重复的基因组区域的甲基化模式。

Pacific Biosciences的测序仪将在今年上市,目前该公司已经挑选了北美10个研究机构,作为第一批试用者,其中包括贝勒医学院、Broad研究院、冷泉港实验室和斯坦福大学等。该公司计划于今年晚些时候在欧洲和亚洲开展早期试用计划。(生物通 余亮)

原文摘要:

Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing

Nature Methods Published online: 9 May 2010 | doi:10.1038/nmeth.1459

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