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IHC全攻略8:问题到底出在哪儿?[心得点评]
【字体: 大 中 小 】 时间:2013年03月11日 来源:生物通
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从技术上说,IHC和ICC实验并不难,然而,每个实验又有那么多的变量需要鉴定和优化。若运气不佳,实验结果不太好,那么我们可能要做个troubleshooting,看看问题到底出在哪儿。下表就列出了IHC/ICC实验的常见问题,以及相应的对策。
从技术上说,IHC和ICC实验并不难,然而,每个实验又有那么多的变量需要鉴定和优化。若运气不佳,实验结果不太好,那么我们可能要做个troubleshooting,看看问题到底出在哪儿。下表就列出了IHC/ICC实验的常见问题,以及相应的对策。
问题1:缺乏染色
对策 缺乏抗原 通过原位杂交检查蛋白表达。 因储存不当,抗体不起作用 按照说明书上的说明储存。一般来说,将抗体分装成小份,足够单次实验使用。将这些抗体储存在手动除霜的冰箱中(-20 to -70 °C),避免反复冻融。 一抗或二抗失活 独立检测报告系统,以评估试剂是否有用。 组织固定不足 尝试增加固定时间或换一种固定剂。 组织过度固定 减少浸润或固定后步骤的持续时间。如果浸润固定无法避免,那么通过抗原修复试剂,让抗原不被遮蔽。 一抗与二抗不兼容 使用能与一抗相互作用的二抗。例如,如果一抗来自兔子,那么就使用抗兔的二抗。 在固定或包埋过程中表位已改变 通过各种抗原修复技术尝试恢复免疫反应性。 在58°C或以下包埋组织。 抗原修复不起作用 增加处理时间或改变处理溶液。 试剂遗漏或顺序不对 重复染色过程,确认使用了正确的试剂,并以正确顺序添加。
问题2:高背景
对策 | |
一抗或二抗的浓度高 |
滴定抗体,以确定促进一抗和二抗的特异反应所需的最佳浓度。。 |
组织中抗体和蛋白的疏水相互作用 |
降低抗体稀释液的离子强度(特别是单克隆抗体)。 |
一抗或二抗与组织的非特异结合 |
在一抗孵育之前采用封闭步骤(通常使用1% BSA和10% 正常驴血清)。脱脂奶粉也是个选择。 |
二抗的非特异结合 |
使用交叉反应性IgG被去除的抗体。 |
组织变干 |
在染色过程中避免让组织变干。 |
离子相互作用引起的背景 |
提高稀释液的离子强度。 |
问题3:细胞/组织形态被破坏
可能原因 |
对策 |
抗原修复方法太过剧烈 |
根据经验确定实验条件,既能保留组织形态,又能恢复抗原的免疫反应性 |
组织切片从玻片上脱落 |
增加固定时间。根据经验确定另一种固定剂。 |
组织切片撕裂或折叠。切片下有气泡 |
重新切片,或在分析结果时忽略受损区域。 |
组织形态的分辨率差 |
切出更薄的组织切片。冰晶可能会破坏冰冻切片的形态。 |
固定不足在染色过程中会导致组织或细胞受损 |
延长固定时间。提高固定剂/组织的比例。切出更小的组织,以便更彻底的浸润。 |
组织自溶导致坏死碎片的染色 |
延长固定时间、比例。考虑使用交联的固定剂。 |
问题4:染色不当
可能原因 对策 固定方法不当 尝试另一种固定剂,或延长固定时间。 抗原修复可能不当 尝试另一种抗原修复条件。 抗原的静电荷被改变 尝试调整抗体稀释液的pH或阳离子浓度。 固定拖延导致抗原扩散 快速固定组织。尝试交联固定剂,而不是有机固定剂。
(原文来自R&D Systems,生物通编译)