多功能微孔板检测仪在TRF方面的应用[创新技巧]

TRF是近十年发展起来的一种微量样本检测方法，尤其适合用来检测复杂样本中的微量成分，是多功能微孔板检测仪在荧光检测方面的重要应用之一。TRF常用在配体受体结合、蛋白质间相互作用、新生儿疾病筛查、高通量药物筛选、细胞因子检测等方面。

时间分辨荧光检测法（TRF）是近十年发展起来的一种微量样本检测方法，具有高灵敏度、高准确性、抗背景荧光干扰能力强的特点，是目前*常用的微量样本分析方法之一。TRF利用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了检测灵敏度。

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在多数生物溶液和血清中，许多复合物和蛋白质本身就可以发荧光，在使用传统的快速荧光基团进行目标物质的检测时会受到背景荧光的干扰，使*终检测到的发射光中会掺杂很多的背景噪声，极大地影响了实验的灵敏度和准确性，尤其是在检测复杂样本中的微量成分时，背景荧光对实验结果的干扰尤为严重。所以为了降低背景荧光，我们可以使用长寿命的荧光基团结合时间分辨的检测方式（在荧光激发和发射光检测之间有一个时间延迟）可将背景荧光的干扰降到*低。

TRF常用的长寿命荧光基团为稀土元素中的镧系元素（铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)、铽(Tb)），其中*常用的是铕元素。与传统荧光基团相比，镧系元素具有大的Stoke’s位移和非常长的发射半衰期（从微秒到毫秒），这些特性使镧系元素在生物学荧光应用领域中占有日益重要的地位（见图1）。在实际操作中，镧系元素在受到激发后能量会缓慢的释放，此时将激发光源停掉，在没有激发光的情况下，复合物或者蛋白质聚集体的背景荧光会很快消失，而镧系元素的发射光会持续很长时间，通过时间分辨的检测方式（延迟检测），我们就可以避免背景荧光对实验结果的干扰，从而提高检测特异性和灵敏度（见图2）。

图1.  镧系元素荧光光谱图

图2.  TRF原理简单示意图

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由基因有限公司代理的BioTek Synergy系列产品中，滤光片荧光检测系统和高能氙闪灯的独特设计使Synergy系列产品在TRF的检测中具有极高的特异性和灵敏度，其TRF的检测下限可达6 amol/孔 384孔板，推荐型号Synergy H4/H1/2。接下来就简单介绍3个BioTek Synergy系列在TRF方面的应用实例。

Nunzianna Doti等[1]利用Eu3+标记的抗IKB-α磷酸化抗体（Ser32/Ser36）和时间分辨荧光检测技术（TRF），通过检测底物IKB-α的磷酸化水平，从而达到检测IKKβ激酶活性的目的，进而建立了基于TRF技术的检测IKK-β激酶活性的高通量技术体系。

Aik Jiang Lau等[2]利用铽标记的谷胱甘肽转移酶抗体和时间分辨荧光检测技术（TRF）进行人孕烷受体（PXR）的竞争性配体结合分析。由于实验采用了TRF检测技术，成功地避免了背景荧光的干扰，获得了一个准确性好、可信度高的实验结果。

AvrPto是丁香假单胞菌的效应蛋白，其氨基酸序列中**的色氨酸残基（Trp）位于该蛋白螺旋束的核心区域，而Trp在286nm的激发下会发射360nm的特异光。Jennifer E.Dawson[3]等在其已发表的研究AvrPto的文章中，利用时间分辨荧光检测技术（TRF），通过测量Trp的荧光强度，从而研究AvrPto在不同pH值溶液中的结构稳定性。

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[1] Nunzianna Doti, Daniela Marasco, et al. Optimizing a Kinase Assay for IKKβ on an HTS Station. Journal of Biomolecular Screening
[2] Aik Jiang Lau, Guixiang Yang, et al. Human Pregnane X Receptor Agonism by Ginkgo biloba Extract: Assessment of the Role of Individual Ginkgolides. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics.
[3] Jennifer E.Dawson,Jolita Seckute,et al.Elucidation of a pH-folding switch in the Pseudomonas syringae effector protein AvrPto. PNAS