轰动科学界的LASSO克隆技术，了解一下[创新技巧]

克隆整个微生物组，这似乎是一个很大胆却又难以实现的想法。当Lorenzo Tosi博士向他的导师 – 哈佛医学院附属麻省总医院的助理教授Biju Parekkadan提出这个概念时， Parekkadan博士立即表现出极大的兴趣。

“一直以来，我都对开发生物学文库很感兴趣。不过，当我们真正开始克隆这种复杂的DNA混合物时，克隆较大的开放阅读框（ORF）显然是最先遇到的技术难题。于是，我们放慢节奏，试图先跨过这个障碍，”Parekkadan博士说。

他们开发的解决方案于2017年6月在《Nature Biomedical Engineering》杂志上发表，立即引起了科学界的极大关注。这种名为LASSO（long-adapter single-strand oligonucleotide，长接头单链寡核苷酸）的探针能够一次捕获数千个DNA碱基对。

LASSO探针是单链的DNA片段，主要由三部分组成，包括与DNA目标互补的连接臂和延伸臂，以及两条臂之间长的接头序列。顾名思义，它就像一个套索，套住了目标基因。

它的克隆效率也让科学界震惊。以往人们只能一次克隆一个基因，而LASSO探针能够克隆数千个片段。“由于连接臂和延伸臂在反应过程中始终在一起，故同一反应管中可实现高度多重的分析，因此可以最低的成本同时合成数千个探针，”Tosi博士解释。

与捕获DNA序列的传统技术 – 分子倒置探针（MIP）相比，LASSO探针显然更加高效。MIP通常可捕获长度为200个碱基对的序列。较长的MIP可捕获长达500个碱基对的片段，不过这种方法需要对每个探针进行独立的反应，严重限制了扩展能力。

在研究人员开展的概念验证研究中，一组LASSO探针能够同时捕获大肠杆菌K12品系的3,000多个DNA片段，它们含有大约4,000个注释的ORF，大小从200个碱基对到近5,000个碱基对不等。

如今，这个项目正在向着更高的目标努力。Tosi博士、Parekkadan博士以及约翰霍普金斯大学的病理学助理教授H. Benjamin Larman博士在申请重点技术开发奖，希望将LASSO探针研究提升到一个新的水平。

Parekkadan博士表示：“一个关键的因素是改善计算方面的问题。为了设计这些探针，我们建立了一种计算算法，能够帮助我们选择基因组中的目标，然后开发出短的前体探针，它们是构建最终的LASSO探针的原材料。现在，我们正在改进这些探针的设计，使其更加有效，并且最大限度地减少特定目标所需的探针数量。”

捕获人类基因

与此同时，研究团队还计划扩展这个平台。尽管之前的概念验证研究主要是针对细菌，具体来说是大肠杆菌K12品系，但他们也开始研究如何捕获人类基因，以及基因组的非编码区。

“针对这些不同目标，探针设计也是全新的，”Parekkadan博士说。“还有一个问题是：人类基因组远比细菌基因组复杂。当我们将实际的探针库与DNA样本混合时，这需要我们更深入地了解捕获反应，从而优化人类基因组的反应。”关于如何优化反应的细节，他们将在未来的文章中介绍。

在等待主要资助机构的一大笔资助的同时，这个研究团队必须尽可能地做出选择，以回应他们自最初发表研究成果以来收到的许多合作请求。

“尽管我们还没有与已经联系过的所有合作者合作，但我们一直支持共享我们的方案与试剂，让其他研究人员能够自行调整这项技术，”Larman博士说。“我们目前正在尝试开发一个更详细的实验方案和故障排查方法，让整个科学界都可以使用，并希望在一年内将其提交给《Nature Protocols》。”

研究人员仍在开展实验，看看LASSO探针能够捕获的范围到底有多大。“我们是否能设计探针，使其跨越基因组上的重要区域，以便人们对短读长难以测序的基因组区域进行研究？”Parekkadan博士谈道。

“这些区域通常含有许多重复片段，因此，如果你尝试捕获一小部分，然后进行比对，那么你根本无法比对，因为它们看上去都很像。而这些区域往往是突变的热点，因此不能掉以轻心，”他说。

LASSO也特别适合基因组中某些核苷酸含量特别高的区域，根据过往经验，捕获探针通常难以设计。Parekkadan博士说：“我们可以包裹整个区域，从而最大限度地减少这些含量很高的基因组区域的问题。我们希望通过适当的资源进行大量的开发。拥有一支专注的团队对实现这一目标至关重要。”

（作者：Gina Shaw / 生物通编译）

相关文献

Lorenzo Tosi, Viswanadham Sridhara, Yunlong Yang, et al. Long-adapter single-strand oligonucleotide probes for the massively multiplexed cloning of kilobase genome regions. Nature Biomedical Engineering (2017) doi:10.1038/s41551-017-009