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肿瘤干细胞抵抗放射疗法谜团解开,Covaris 助力 ChIP-qPCR又立大功!

【字体: 时间:2020年12月01日 来源:基因有限公司

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  近期, Nature Communications 在线发表了瑞典卡罗林斯卡医学院Jiri Bartek教授及丹麦癌症协会研究中心Petra Hamerlik教授的联合研究成果。值得注意的是,该ChIP-qPCR实验中的染色质打断步骤借助的是Covaris的聚焦超声打断平台。

真核细胞的基因组DNA以核小体为单位压缩组装成染色质。核小体的存在保护了基因组,但也限制了DNA序列的可接近性,影响到了几乎所有的基于DNA的分子生物学过程,包括DNA的损伤修复。染色质重塑因子能够在特定时间定位于特定的核小体上,通过改变染色质结构,影响DNA损伤的修复,保证基因组的完整性。

多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)是恶性程度最高的颅内实体瘤,确诊患者平均生存期仅有12到15个月。GBM最大的特征是对于放射疗法的明显抵抗力。前期研究表明,面对电离辐射带来的DNA损伤,GBM内部的胶质母细胞瘤干细胞(GBM-derived cancer stem-like cells,GSCs) 亚群,能够保持自身基因组的稳定性和自我更新能力,并不断分化成异质的肿瘤细胞,实现临床意义上的肿瘤复发。然而,其中的机理却一直未知。

近期, Nature Communications 在线发表了瑞典卡罗林斯卡医学院Jiri Bartek教授及丹麦癌症协会研究中心Petra Hamerlik教授的联合研究成果SPT6-driven error-free DNA repair safeguards genomic stability of glioblastoma cancer stem-like cells,通过293个染色质重塑因子的siRNA文库筛选,发现了转录延伸因子和染色质重塑因子SPT6(Suppressor of Ty 6 homolog)对GSC的基因组稳定性和自我更新的关键作用,并通过ChIP-qPCR进一步揭示了SPT6充当GSC中BRCA1表达的转录共激活因子,通过转录上调BRCA1,驱动GSC中的无错误DNA修复的调节机制。值得注意的是,该ChIP-qPCR实验中的染色质打断步骤借助的是Covaris的聚焦超声打断平台。


在GSC中造成DSBs升高的最大诱因是SPT6的下调(图1c),使用siRNA (siSPT6-p)以及单个siRNA进一步证实,SPT6下调诱导DSB增加是GSC所特有的(图1d-f)。

论文中指出,下调SPT6蛋白水平会损害GSC的自我更新以及分化潜力。且将转化了靶向spt6的shRNA的GSCs原位植入免疫缺陷小鼠体内发现,SPT6的丢失使shSPT6-2的荷瘤小鼠的中位生存期从29天延长到43.5天(p = 0.0041),进一步证实SPT6是GSCs致瘤活性的维持因素。此外,研究还发现SPT6沉默可激活DDR、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡,表明SPT6对于DNA损伤修复,细胞周期进程至关重要。

接下来,为了揭示SPT6如何通过影响DNA损伤修复来维持GSCs的基因稳定性,作者首先使用免疫荧光染色显示SPT6未与γH2AX共定位,暗示它对DNA修复的影响可能是间接的。接着作者评估了SPT6缺失对整体转录速率和RNAP II蛋白水平的影响。结果显示当SPT6下调时,整体转录速率下降了50%以上(图4a),且RNAP II的半衰期显著降低(图4c)。使用蛋白酶体抑制剂MG132(20µM,5h)处理,RNAP II蛋白水平增加(图4d)。这些数据表明,在GSC中,SPT6与RNAP II的结合可防止其泛素化介导的蛋白酶体降解,从而保持整体转录速率。

然而,虽然MG132处理恢复了RNAP II蛋白水平,但在沉默了SPT6的GSC中,BRCA1和RAD51的mRNA和蛋白水平仍然较低(图4d),由此,作者推断SPT6对于RNAP II介导的BRCA1的转录至关重要,很有可能充当GSC中BRCA1表达的转录共激活因子。为此,作者进行了ChIP-qPCR分析。证实了SPT6与BRCA1基因启动子的远侧调节区结合。在文中我们可以看到,这次成功的ChIP,染色质打断步骤作者使用的是Covaris M220 超声破碎仪,作用条件为(27 min; peak power: 75; duty factor: 10; cycles/burst: 200)。

BRCA1能够拮抗53BP1依赖的易错DNA修复(error-prone non-homologous end-joining, NHEJ),诱导细胞选择保真的同源重组(error-free homologous recombination, HR)途径修复DNA损伤,防止错误修复带来的有害突变和多倍体性。因此,作者提出在GSCs中,SPT6通过转录上调BRCA1,驱动细胞选择保真的HR途径修复DNA损伤,从而维持基因组稳定性的机制。在U2OS的DNA修复模型中,检测到靶向SPT6的siRNA导致HR抑制的幅度与靶向关键HR蛋白BRCA1的siRNA相似(图5a),以及对S / G2期细胞中53BP1计数评分也表明,SPT6敲低增加了dNHEJ的频率。同时,作者利用异位表达挽救实验,验证了过表达BRCA1能够挽救SPT6沉默时DDR的激活以及DSB诱导。都对这一机制提供了佐证。

最后,作者提出SPT6调控DSB修复途径选择模型,其中SPT6充当GSC中的BRCA1的转录共激活因子,表达的BRCA1诱导DSB进行无错误的HR修复;一旦SPT6 / BRCA1缺失,DNA修复途径的选择将不再被诱导,并允许dNHEJ激活,从而增加GSC的基因组不稳定性,最终导致细胞死亡。使用该模型,作者验证了chaetocin(组蛋白赖氨酸甲基转移酶抑制剂)对引发肿瘤的GSC的治疗作用,并发现30 nM的低剂量chaetocin完全废除了GSC在体内引发肿瘤的能力,为GBM中的SPT6靶向打开了治疗窗口。

参考文献:

Obara, E.A.A., Aguilar-Morante, D., Rasmussen, R.D. et al. SPT6-driven error-free DNA repair safeguards genomic stability of glioblastoma cancer stem-like cells. Nat Commun 11, 4709 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-18549-8

在癌症治疗中,靶向染色质重塑因子以及DDR因子的研究越来越多。然而靶向治疗的前提是需要理清其中的机理。ChIP实验是研究染色质相关的相互作用的有力工具,Covaris聚焦超声破碎仪提供能量可控的、精准的染色质打断,并支持极少样本量的ChIP打断。基因有限公司作为Covaris中国区的合作伙伴和全国代理商,邀您一同关注我们的官方微信“基因快讯”。如需要进一步资料,回复本微信或直接联系基因有限公司各地办事处。

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