单细胞分离，你需要了解的工具和技巧

如今，单细胞多组学分析正在如火如荼地开展，各大杂志上不断有重磅的新成果发表。也许您也跃跃欲试，不过在此之前，您需要分离出单细胞。您理想中的单细胞分离是快速而高效的，而现实中的过程也许是低效而漫长的。在此，我们将介绍一些单细胞分离的新技术，并分享一些操作时的小技巧。

单细胞分离的挑战

准备分离单细胞的研究人员必须克服许多挑战。他们希望获得纯正的目标细胞群，且细胞的各种特征都保持不变。如何才算不错的分离方法？它应当保持细胞活力，提供足够数量的细胞，并且可根据未来的需求而扩展。它还能够防止细胞聚集，并且操作起来相对简单，费用也不太高。

日本On-chip Biotechnologies公司一直致力于开发单细胞分离系统。它的应用科学家Elisa Lam博士认为，在选择合适的技术时还需要考虑通量（也就是一定时间内分离的细胞数）以及回收率（分离得到的目标细胞数与原始样品中的目标细胞数之比）。

FACS的缺陷

由于速度和通量上的优势，荧光激活细胞分选（FACS）是常用的单细胞分离方法之一。不过，这些优点也被一些无法避免的缺点所抵消。Lam博士解释说：“在FACS分选过程中，高速碰撞发生时的高压、电荷和频率会导致一种应激现象，也就是分选仪器诱导的细胞应激（SICS）。这就限制了分选细胞在下游研究中的应用，对于那些研究敏感细胞（如球状体或神经元）的研究人员来说尤其是个问题。”

Namocell公司的应用科学家Rachel Agoglia认为，FACS的缺点是样本量大且操作复杂。“FACS通常至少需要100,000个细胞，因此不能分选数量稀少的样本，比如许多临床样本，”她谈道。“它也容易受到样本交叉污染和系统堵塞的影响。另外，FACS仪器占地面积大，并且需要培训过才能操作，因此不方便放在中心实验室。出于这些原因，许多研究人员正在寻找单细胞分离的替代方法。”Namocell是一家专注于单细胞分离的公司，总部位于美国硅谷。

新兴的微流体技术

与传统的FACS相比，新型微流体细胞分选仪具有不少优势。它们使用较低的分选压力，降低了SICS的风险。它们所需的样本量也较少，可将样本加入一次性的微流体芯片中进行分选。Lam博士认为，基于微流体芯片的细胞分选仪的优势不仅在于处理微升级的样本。“这些系统还消除了样本交叉污染的风险，并且提高了分选细胞的质量。”

近年来，微流体技术已与其他学科整合在一起，进一步加强单细胞分离。Namocell的联合创始人Jessica Zhou解释说，将微流体技术与流式细胞仪和液体分配相结合，让研究人员能够直接分选细胞并分离到微孔板上，一步完成操作。“我们采用卡盒设计，每分钟能够处理数百万个细胞，从而快速分离出稀有细胞，或在抗体开发时挑出最佳克隆，这是FACS或传统分选仪无法做到的，”她说。

Jessica还补充了一些优点：“它跳过了传统分选仪的一些复杂操作，比如微球校准和液滴延迟校准。由于没有死体积，只需100个细胞即可实现单细胞分离，在处理珍贵的临床样本时，这也是一个重要的考虑因素。同时，低分选压力有助于克隆生长，也避免诱导应激基因。”

美国格拉斯通研究所干细胞核心实验室的主任Po-Lin So表示：“我们核心实验室正在寻找一些方法来加速人诱导多能干细胞（iPSC）的克隆，并在单细胞中分析基因编辑效率。”在选择单细胞分离工具时，她有四条标准：1) 无菌，2) 温和，3) 容易使用，4) 价格合理。

她认为：“Namocell的仪器完全符合我们的标准。在生成CRISPR改造的iPSC克隆时，我们能够大大减少时间和精力。而且，仪器几乎不需要维护，使用者也无需接受大量培训，主要要求是掌握良好的无菌技术。”

此外，还有一些技术将细胞分选与基因表达谱分析相结合。BD生命科学的研究员Hye-Won Song博士解释说，如果不首先对细胞进行分选，那么在单细胞水平上研究基因表达将会非常耗时。BD Rhapsody™单细胞分析系统旨在克服这一问题，它在单个平台上分离单细胞并开展转录组分析，从而提高实验效率。

单细胞分离的小技巧

1. 缩短制备单细胞悬液的时间，以保留细胞活力
2. 考虑使用细胞筛来过滤出细胞团块或双细胞
3. 注意缓冲液的选择，包括分选和收集溶液
4. 如果您打算在分选后培养细胞，请使用对数生长期的细胞，并确定最佳培养条件
5. 在分选转染后的细胞时，通常在转染后72小时进行，以提高细胞群的生存能力
6. 如果采用荧光抗体来分离稀有细胞，请在染色前离心抗体，以便去除任何可能被误认为是靶细胞的荧光颗粒
7. 对于单细胞基因组学应用，在分选后别忘了离心平板，以确保细胞在孔的底部
8. 选择一种可靠的分析技术来评估分选细胞的数量和质量