【字体: 时间:2021年10月01日 来源:赛业生物

编辑推荐:

  您有没有考虑过基因编辑小鼠模型应用中会有哪些常见风险?是否会对结果分析造成哪些影响?业界重量级资深技术大咖进一步为您详细解析:Cre-loxP位点重组系统应用中常见风险及影响因素。精彩好文,全是干货,不可错过!

作者:俞晓峰  赛业生物首席科学家/中国区副总裁

      应用基因编辑小鼠模型研究基因的功能、揭示疾病致病机制过程,为药物研发的临床前研究,发挥了不可取代的作用。Cre-loxP位点特异性重组系统(简称Cre-loxP重组系统)的建立,为完善基因编辑小鼠模型的构建,进一步开展条件性靶基因功能的研究,提供了有效工具。回顾Cre-loxP重组系统在小鼠研究中的实际应用,研究者们认识到,对该技术应用中存在的某些风险与影响因素,给予充分了解与关注,将有助于提升靶基因编辑小鼠模型研究结果的准确性与可靠性。

文章亮点
一、Cre-loxP位点特异性重组系统应用基本原理
二、应用Cre-loxP位点特异性重组系统,实现小鼠条件性靶基因功能研究
三、不同Cre小鼠模型构建策略及方法特点
四、为什么要构建诱导性调控CreERT小鼠模型及其基本特征
五、Cre转基因小鼠模型中Cre插入位点鉴定的挑战与重要性

六、Cre-loxP位点重组系统应用中常见风险及影响因素
七、Cre-loxP位点特异性重组系统应用中的思考与建议

正文续前

六、Cre-loxP位点重组系统应用中常见风险及影响因素
1. Cre非特异性/错误重组作用/随机插入突变的影响因素
2. Cre重组酶高表达的毒性作用
3. Cre生殖系重组作用与小鼠性别影响
4. Cre作用的镶嵌现象 (Mosaicism)
5. 小鼠遗传背景影响作用
6. TAM应用中相关问题:关于TAM有效诱导的最优剂量与途径  及 TAM诱导毒性

      Cre小鼠模型作用的一致性与可重复性,是分析解释实验结果可靠性的保证。然而,回顾过去研制的一些Cre小鼠模型,观察分析其实际应用中的情况发现,不少所谓特异性Cre小鼠模型,其Cre的靶基因切割活性,明显存在不均匀和/或不一致的现象。比如,MMTV-Cre、Krt19-Cre、Gata4-Cre和Nes-Cre/ERT2小鼠等, 都报道有不同程度泄露表达等非特异性作用效果。 

      某些Cre小鼠模型,常出现Cre非特异性/非预期/异位等异常表达现象, 从而影响表型结果分析及解释的准确性。比如,Myh6-Cre、Ins2-Cre、Vil-Cre、Ddx4-Cre和Pdx1-Cre等。也有些Cre小鼠模型表现有生殖系细胞作用活性,从而引起Cre-loxP重组系统的广泛而非特异性的切割作用。

      关于Cre小鼠的所谓非特异脱靶重组作用的原因,目前多认为,与如下因素有关,第一,应用不同的Cre小鼠构建策略与技术;第二,Cre小鼠起初研制的时候,研制者很明确其实际应用的特殊目的,从而导致对Cre小鼠特征鉴定的关注点存在偏差,忽略了对其进行全面完整而系统的相关分析。然而,当这些Cre小鼠模型成为公共应用资源后,由于研究者们的广范围应用,也使人们有更多机会对其期望作用的靶组织,以及作用范围区域和多个时间点的细胞/组织类型等重组切割活性,进行更加精确及深入的实验研究。

      Cre小鼠令人困惑的潜在非特异性作用的脱靶活性风险,以及引起可能的毒性作用,不仅可导致靶基因敲除小鼠的死亡,或非靶基因敲除引起的非特异性表型。由于这类Cre小鼠引起的脱靶活性作用,其实已代表了Cre的真正活性作用,自然也限制了这类小鼠模型,未来进一步应用的价值。

1. Cre非特异性/错误重组作用/随机插入突变的影响因素

      目前常用的Cre小鼠模型多为传统转基因技术构建,即采用所谓细胞/组织特异性的启动子部分DNA片段策略,加上基因随机插入,可能产生所谓的基因表达位置效应等特征,造成Cre表达的不准确或泄漏,难以真实反映真正期望的特异性,导致Cre表达出现脱靶切割作用。

      有研究通过分析常用的几种胸腺特异性Cre转基因小鼠模型(比如Lck-Cre, CD2-Cre和CD4-Cre)的非特异性作用时发现,虽然这些小鼠均是应用胸腺特异性启动子构建的,但Cre表达,可导致小鼠胸腺细胞量中等或严重程度的减少,且表现有剂量和拷贝数量依赖的特征。

      由于Cre重组酶非特异性识别并作用于基因组中与loxP位点相似的序列,也称隐秘loxP(cloxP) 位点,引起Cre-cloxP位点的非特异性重组切割作用,从而有可能导致重要或关键基因破坏,轻则引起非特异性细胞表型,重则研究组织器官破坏或小鼠死亡。 

      对Tek-Cre小鼠模型进行基因插入位点分析研究表明,由于Cre的随机插入,导致241-kb大小DNA缺失, 影响到相关蛋白编码基因(比如Mtrr、Fastkd3和Adcy2等)表达, 且小鼠出现发育异常的表型,而该表型可能与Mtrr基因的缺失有关,因为Mtrr基因敲除小鼠,即可导致后代小鼠发育严重障碍。

      另外,在分析某些Cre转基因(比如Ins2-Cre、Nes-Cre、Alb-Cre和Lck-Cre)小鼠模型也发现,某些非预期DNA成分出现,比如,人生长激素 (hGH) 微小基因片段。并观察到Nes-Cre和Ins2-Cre两种小鼠品系都出现代谢方面的明显表型,且Ins2-Cre小鼠出现不明原因的,与年龄相关的糖耐受异常。但Alb-Cre和Lck-Cre两种小鼠品系,却未见相似表型。表明hGH微小基因在不同转基因小鼠中,可表现不同的表达及影响作用。

      也有报道发现,在分析的40种转基因Cre小鼠模型中,有10种Cre小鼠伴随有E.coli DNA序列的污染,DNA片段大小由~300 bp到超过200 kb。且证实,小DNA片段与克隆载体如pBACe3.6相同。出现细菌和载体DNA相互污染的推测原因,可能与注射载体DNA制备过程有关。但关于此类污染的影响作用,目前还不太明确。但有研究报道,细菌DNA序列可沉默及影响转基因的表达。

      一般认为,随机插入转基因构建Cre小鼠模型的策略与技术,存在许多不确定的风险。比如,Cre随机插入,干扰附近内源基因表达水平,从而导致Cre作用的所谓脱靶表达现象。

      即使应用定点敲入策略构建Cre小鼠模型,也可能造成相应基因表达影响,导致该小鼠模型出现一定的病理改变表型。特别是采用将Cre敲入内源基因的5’端构建策略。比如,Foxg1-Cre敲入/敲除小鼠,就是在Cre敲入内源性Foxg1基因位点同时,也敲除了该基因,而 Foxg1基因参与小鼠大脑半球发育过程,所以,该Cre纯合子小鼠在围产期死亡。 虽然,Foxg1- Cre杂合小鼠,仍可发挥脑部组织特异性靶向作用,实现小鼠大脑半球、视前/视囊泡、嗅觉上皮神经和咽囊部等部位靶基因特异性敲除的目的。 

2. Cre重组酶高表达的毒性作用

      Cre重组酶在细胞内的大量蓄积,可直接引起DNA破坏及细胞死亡。研究已表明,对于高表达Cre的转基因小鼠,表现为其存活及繁殖能力降低。CAG-Cre和CD2-Cre小鼠模型就是典型例子。

      Myh6-Cre小鼠是心肌特异性常用小鼠模型, 借助aMyHC启动子及随机插入转基因的策略构建而成。对比小鼠Cre不同表达水平的影响作用发现,Cre高表达小鼠发生非特异性重组作用,从而影响到小鼠心肌的正常功能。而Cre低表达转基因小鼠,则无非特异性重组作用。研究者认为,高表达的Cre与小鼠体内某些所谓隐秘loxP(cloxP)位点,发生非特异性的重组切割效应,达到破坏相关基因功能的作用。

      神经元细胞中高表达的Cre可引起小鼠脑发育受损。研究分析Nestin-Cre和两个Nestin-CreERT2转基因小鼠品系证实, 所有纯合Nestin-Cre小鼠,都有胚胎发育延迟及神经元增殖降低、异倍体增加与细胞凋亡病理现象、最终导致小鼠小脑症和脑积水等发育缺陷表型。

      高水平Cre表达也可直接影响视网膜色素上皮细胞功能。比较分析不同视网膜色素上皮细胞 (RPE) 特异性Cre转基因小鼠后发现,常用Trp1-Cre转基因小鼠本身,就伴随RPE单层细胞结构混乱、RPE区域萎缩、视网膜感光细胞功能丧失、以及小胶质细胞激活等病理变化。

      作为代谢性疾病常用的RIP (Ins2)-Cre小鼠,也见有糖耐受反应或诱发糖尿病发生,并推测可能与胰岛素分泌受损有关。

      有报道表明,诱导性肠特异性Villin-CreERT2小鼠,经TAM激活后,可借助隐秘loxP位点,引起非特异性DNA破坏作用。

3. Cre生殖系重组作用与小鼠性别影响

      通过对64种不同神经系统相关Cre小鼠模型研究发现,有64.1%小鼠有生殖系重组作用,且29种(占82.8%) 有性别差异,其中父本Cre小鼠有完全或选择性生殖性重组活性作用占62.1%,而母本Cre小鼠则只占20.1%。只有17.2%的Cre小鼠,具有相似的生殖系重组作用。 比如,Foxg1-Cre/floxed 双基因编辑雄性小鼠与野生雌性小鼠交配的后代,会出现有一定程度生殖细胞基因敲除现象(68.8%),但未见Foxg1-Cre雌性小鼠的生殖细胞作用。

      分析这些Cre小鼠出现生殖系重组作用的可能原因及其影响因素,包括小鼠模型构建策略技术本身,比如,转基因还是定点敲入策略、启动子的选择、Cre插入位点及表达水平、5’ 端还是3’端敲入、IRES与2A连接方式等都可为潜在影响因素。比如,所谓内皮细胞特异性Tek-Cre (Tie2-Cre)转基因小鼠模型,多是借助Tek基因的2.1 kb启动子加10 kb内含子片段区域构建而成。结果发现,该Cre表达活性出现于小鼠胚胎7.5天,且表现一定程度造血干细胞系的重组活性。且母本小鼠显示有明显的生殖系重组作用。现已证实,因Tek基因调控序列在胚胎发育过程及生殖系细胞具有活性作用,从而引起了靶基因在生殖系被敲除的结果。

4. Cre作用的镶嵌现象 (Mosaicism)  

      由于变化或不一致的Cre表达作用,导致同一小鼠体内不同细胞或组织中,Cre重组切割作用活性及效率表现差异,因而引起靶基因在不同细胞或组织被敲除的效果,呈现不一致的现象。比如,Vav1-CreFabp4-Cre小鼠品系,其Cre小鼠作用的子代同窝小鼠中,因Cre作用引起的遗传改变相关表型,也存在差异的可能性。另外,EIIa-Cre小鼠作为常用的广泛细胞组织靶基因完全敲除的工具,实际应用中也被证实,雄性Ella-Cre小鼠明显有镶嵌表达的特性,而雌性Ella-Cre小鼠的重组切割活性, 则更加均匀一致。因而建议用雌性Ella-Cre小鼠与条件性靶向(floxed) 雄性小鼠进行交配,以获得更为理想而完整的重组切割效果。

5. 小鼠遗传背景影响作用

      研究已发现,不同遗传背景的同一Cre小鼠模型,其重组切割活性作用也可不同。比如,眼睛特异性Le-Cre转基因小鼠所引起的眼睛异常表型,就与其遗传背景的影响有关。当该Cre小鼠常用FVB/N品系与CBA/Ca遗传背景小鼠交配7代后,部分CBA/Ca品系的Le-Cre小鼠,出现明显眼睛异常表型。且CBA/Ca品系小鼠眼睛表型的严重性及出现频率,也可通过回交FVB小鼠2代而逆转消除。

6. TAM应用中相关问题

      CreERT2-loxP位点特异性诱导性重组系统,需要诱导剂TAM参与完成。然而,实际应用中,有许多因素可影响其作用效果,并可能引起非特异性及相关毒副作用,则应加以了解关注与重视。

(1)关于TAM有效诱导的最优剂量与途径

      通过对已报道的CreERT小鼠品系应用研究分析中,寻找最佳TAM诱导有效性是比较困难的,部分原因是因为不同研究,应用了不同的实验方案策略与操作流程,包括多种不同的TAM制备及使用剂量,各种给药途径等。比如,Columbia大学对相关研究者们的问卷调查表明,TAM制备方法(玉米油配制为多,其次为向日葵油和花生油等)、使用剂量(20mg~175 mg等)、给药途径及次数(腹腔注射最多,包括有单次、2-4次和5次等,其次为口服灌胃等)、以及诱导效果检测方法(RT-PCR和免疫荧光染色为主)等均有明显不同。

      虽然,目前大部分研究都是采用TAM腹腔注射(IP)给药的方式,但也有研究比较了IP给药与口服灌胃(PO)给药方式效果,发现PO方式在降低TAM毒性方面,可能更有优势。且发现老年CreERT小鼠,往往需要更高剂量与更长时间TAM诱导,以获得满意的CreERT作用活性。

      关于最佳TAM有效诱导剂量与给药途径,目前的相关知识仍很有限,需要继续探索与积累。也建议研究者根据实际具体情况,筛选出适合研究计划的最佳剂量与途径。

(2)TAM诱导毒性

      目前已经明确,高剂量腹腔给药TAM,有长期毒性作用,可增加小鼠发病及死亡率。比如,广泛诱导性R26CreERT2小鼠,如果使用高浓度TAM(175 mg/kg, 口腔连续5天)诱导,小鼠出现胸腺萎缩、严重贫血、以及造血细胞异常染色体重排等造血系统相关毒性反应。

      也有研究发现,心肌特异性诱导表达的MerCreMer (MCM) 转基因小鼠,经中高剂量TAM(60~90 ug/g, 腹腔连续3~5天)处理后,~60-80%的MCM小鼠出现心脏纤维化,且伴有促炎症细胞因子表达的增加,  最终导致心脏功能衰竭及小鼠死亡。但减少TAM诱导使用剂量或次数(比如30 ug/g,腹腔连续3天给药),不仅可以实现Cre特异性重组作用的最大化(~84%),且最低程度降低其心脏毒性作用的效果。同时,建议应用TAM处理的MCM小鼠作为实验对照。

      进一步分析MCM小鼠CreERT转基因插入位点证实,该MCM转基因插入到小鼠基因组染色体19的C1区域,导致约~20 kb基因组片断缺失,该片断包含A1cf基因外显子1及部分内含子1区域。

      关于TAM诱导MCM小鼠心脏毒性的可能原因,相关研究认为,TAM诱导的心脏纤维化及心脏衰竭,不是由于MCM的随机插入位点及TAM使用剂量本身的高低引起的,而是因为中高剂量TAM诱导作用,使Cre表达相应增加,从而引起可能的Cre与cloxP隐秘位点的非特异性重组切割有关。因为,(1)不同年龄的MCM小鼠本身未见心脏纤维化现象;(2)同样高剂量TAM诱导野生B6小鼠,未见小鼠心脏纤维化改变;(3)高剂量TAM可引起MCM小鼠体内心肌细胞程序性死亡增加,且可能与DNA破坏激活及p53基因稳定性下降有关;(4)体外原代细胞证实,高表达Cre重组酶,能直接引起细胞的程序性死亡。

      有研究对不同策略构建(随机插入和定点敲入)的两种诱导性CD4-CreERT2小鼠品系比较分析,通过将其分别与纯合Rosa26-loxP-stop-loxP-YFP报告小鼠进行交配,TAM诱导后,观察体内T滤泡辅助细胞(Tfh) 动态适合反应,并用不完全蛋白偶联的NP-KLH抗原免疫小鼠,以诱发辅助性Tfh细胞的分化。结果发现,高表达CD4-CreERT2随机插入转基因小鼠,可降低了辅助性Tfh细胞分化数量,干扰了细胞的存活。而低表达CreERT2的定点敲入小鼠, 则能避免因Cre表达过高造成的细胞损失作用,且仍能有效发挥其淋巴细胞特异性重组效率。

      前面介绍的TAM诱导的毒性作用研究报道,多与高剂量TAM使用及高表达Cre作用相关。但最近有研究表明,低剂量TAM(20 mg/kg)诱导也会影响小鼠骨形成。研究者采用不同剂量TAM(0、20、40和200 mg/kg,腹腔连续4天)诱导4周龄野生B6小鼠,结果表明,20 mg/kg剂量TAM诱导,即可引起小鼠股骨体积比(骨体积/总体积)增加153%。因此提示,即使应用非常低剂量的TAM诱导,在实际CreERT骨特异性靶基因敲除/表达的研究中,也需要考虑TAM诱导可能影响到小鼠骨小梁和皮质骨的形成过程。(未完,精彩后续内容请点击继续阅读

前后连载

技术连载:Cre-loxP位点特异性重组系统在小鼠条件性靶基因功能研究中的应用

七、Cre-loxP位点特异性重组系统应用中的思考与建议

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器云展台 | 免费试用 | 今日视角 | 新技术专栏 | 技术讲座 | 技术期刊 | 会展中心 | 中国科学人 | 正牌代理商

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号