mRNA疫苗质控---NanoDrop有妙招

【字体: 时间:2022年10月27日 来源:基因有限公司

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  在制备mRNA疫苗的多个环节中,均可使用NanoDrop™ One/OneC或 NanoDrop Eight进行关键质控。

前言

随着新冠病毒的大流行,mRNA疫苗因其安全性、有效性和高产量而在结束大流行的斗争中越来越受欢迎1。mRNA疫苗通过特定的递送系统将表达抗原靶标的mRNA导入体内,在体内表达出蛋白并刺激机体产生特异性免疫学反应,从而使机体获得免疫保护2。在制备mRNA疫苗的多个环节中,均可使用NanoDrop™ One/OneC或 NanoDrop Eight进行关键质控。

一、测序前样品质控

mRNA疫苗的早期生产始于核酸提取和测序准备。为了准确有效的对核酸进行测序,最重要的是起始材料具有一定的质量和数量3。宾夕法尼亚州立大学的基因组学核心设施要求用于测序的总RNA不含任何污染物。由于当前市面上有多种核酸提取试剂盒和方案,浓度、产量和纯度可能因每个试剂盒或方案而有所差异。为避免这种潜在的不确定性,在核酸提取步骤之后可使用NanoDrop One/OneC或NanoDrop Eight进行测序前的质控。

内置于NanoDrop One/OneC和NanoDrop Eight内的Acclaro™智能样本检测技术可准确给出污染物类型。常规方法是通过核酸纯度比来量化纯度,如:A260/A280和A260/A230。然而,对于传统的UV-Vis光谱测量,在同一波长处吸收的任何材料都将增加整体吸光度。例如,RNA中的污染物dsDNA,这两种核酸均在 260nm处有吸收峰,因此将会高估了RNA浓度。为了解决这个问题,Acclaro™技术利用化学计量学算法来区分RNA和dsDNA以及常见的提取试剂材料,如苯酚和胍盐等,大大优化了测序的准备流程。

二、质粒生产过程的监测

完成测序过程后,通过限制性内切酶和DNA连接酶将目标基因插入质粒中,构建重组质粒DNA。将重组质粒转化到大肠杆菌中,然后根据抗生素抗性选择或菌落颜色筛选挑取细菌细胞4。选择含有质粒的菌落在培养基中培养,使用NanoDrop测量培养物以确定密度是否适合质粒纯化,通常在600nm处为2.0–4.0OD(取决于纯化试剂盒)。之后使用试剂盒从细胞培养物中纯化质粒,去除基因组DNA 或其他污染物。纯化后的质粒可在NanoDrop One/OneC或NanoDrop Eight上进行检测,并通过Acclaro™技术来识别纯化后是否还残留污染物,以达到对质粒质控的目的。

三、mRNA中的污染物检测

当通过NanoDrop分光光度计测量并确定重组质粒纯度后,质粒被线性化,聚合酶开始在感兴趣的基因之前转录。聚合酶从DNA模板合成mRNA,并且mRNA 被加帽以确保高效地翻译成蛋白质5。当mRNA合成完成时,DNA被DNase降解,mRNA进行最终纯化以去除污染的转录物质1,NanoDrop One/OneC或 NanoDrop Eight通过Acclaro™技术可快速确认mRNA的纯度,防止因污染抑制蛋白质翻译而降低疫苗效力1

结论

NanoDrop One/OneC和NanoDrop Eight通过内置的Acclaro™智能样品检测技术,可以分析样品中的污染物,对mRNA疫苗生产的重要环节进行关键质控。同时电脑端软件支持21 CFR Part 11,可应用于GMP实验室进行mRNA 疫苗生产工作。NanoDrop 分光光度计为mRNA质控提供了一种快速简单的方法,有效增加了疫苗的生产效率。

参考文献:

1.Pardi,N.,Hogan,M.,Porter,F.et al.mRNA vaccines—a new era in vaccinology. Nat Rev Drug Discov 17,261–279 (2018).https://doi.org/10.1038/nrd.2017.243
2.CDC—National Center for Immunization and Respiratory Diseases-Understanding mRNA COVID-19 Vaccines. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/vaccines/different-vaccines/mrna.html. November 17,2021.
3.The Pennsylvania State University.(n.d.).RNA-seq sample guidelines—the Huck Institutes.Genomics Core Facility. https://www.huck.psu.edu/core-facilities/ genomics-core-facility/sample-recommendations/rna-seq-sample-guidelines. November 19,2021.
4.Cohen, S. N.,Chang,A.C.,Boyer,H.W.,& Helling,R.B.(1973). Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,70(11),3240–3244. https://doi.org/10.1073/pnas.70.11.3240
5.Steve Pascolo (2004) Messenger RNA-based vaccines,Expert Opinion on Biological Therapy, 4:8,1285-1294. https://doi.org/10.1517/14712598.4.8.1285

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