高效反转录——lncRNA等低拷贝RNA检测的关键

【字体: 时间:2022年04月25日 来源:Takara

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  PrimeScript反转录酶的敏感性已被充分证明,例如,根据文献内容,该酶在total RNA pool中可以检测到10-21 mol miRNA,同时,该酶的特异性可以区分含有单碱基错配的miRNA。

RT-qPCR是检测低拷贝RNA的一种比较实用的技术,RNA拷贝数低,对于检测灵敏度和准确度的要求非常高。

● 由于样本或细胞类型的本身质量问题,或RNA本身表达水平低,感兴趣的RNA分子可能以低拷贝数存在。例如,虽然某些组织(如肝脏)每毫克中含有微克数量的RNA,但在其他组织类型中(如骨骼或脂肪),等量的组织中可能含有小于1%的RNA。

● 样本本身是一个限制因素,而冷冻或保存的FFPE组织等样本可能是不可替代的或非常珍稀宝贵的,因此获得可靠的RT-qPCR数据至关重要。

● 在长期储存过程中也可能会造成RNA损失。

● 调节蛋白如转录因子对细胞功能有很强的影响,但也可能在低水平表达。

● 还有一些RNA分子如非编码RNA(pre-miRNA、miRNA、lncRNA等)也可能以低拷贝数存在。

使用传统技术检测这些目的RNA可能是比较困难的。

反转录酶的效率是RT-qPCR敏感性的主要限制因素之一。

PrimeScript反转录酶的敏感性已被充分证明,例如,根据文献内容,该酶在total RNA pool中可以检测到10-21 mol miRNA,同时,该酶的特异性可以区分含有单碱基错配的miRNA。

以下总结了使用PrimeScript反转录酶对具有挑战性的RNA样本RT-qPCR检测的文献。

病毒RNA

检测小鼠肺组织中的甲型流感病毒: Zou, Q., et al. Use of praziquantel as an adjuvant enhances protection and Tc-17 responses to killed H5N1 virus vaccine in mice. PLoS ONE 7, e34865 (2012).

H5N1甲型禽流感病毒具有高致病性,需要更多关于如何诱导广泛的细胞毒性T淋巴细胞对H5N1灭活疫苗产生反应的信息。文献报告,吡喹酮 (PZQ) 佐剂可增强小鼠对H5N1病毒致死剂量攻击的保护作用。小鼠肺组织中的病毒量检测使用了One-Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II (Perfect Real Time)(Code No. RR086)

Long non-coding RNA (lncRNA)

PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) 用于分析lncRNA: Mizutani, R., et al. Identification and characterization of novel genotoxic stress-inducible nuclear long noncoding RNAs in mammalian cells. PLoS ONE 7, e34949 (2012).

作者使用生物信息学方法鉴定了可能参与基因毒性应激反应的新lncRNA分子,并使用PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) (Code No. RR036)通过RT-qPCR研究了表达模式。

miRNA and pre-miRNA

PrimeScript Reverse Transcriptase 用于检测10-21mol miRNA: Yao, B., et al Quantitative analysis of zeptomole microRNAs based on isothermal ramification amplification. RNA 15, 1787 (2009).

作者报告开发了一种灵敏且特异的等温分支扩增 (RAM) 实时测定法, 用于miRNA 的定量分析,无需进一步富集即可准确定量总RNA 样品中的 miRNA。PrimeScript Reverse Transcriptase(Code No. 2680)用于将 miRNA 初始反转录为 cDNA。

PrimeScript RT reagent Kit用于分析pre-miRNAs: Tang, Y., et al. Genome-wide analysis reveals diversity of rice intronic miRNAs in sequence structure, biogenesis and function. PLoS ONE 8, e63938 (2013).

虽然大多数 miRNA 位于基因间区域,但有些存在于内含子 (in-m iRNA) 中。作者在水稻中发现了新的 in-miRNA 分子,并使用PrimeScript RT reagent Kit (Code No. RR037)通过终点法 RT-PCR 分析 pre-miRNA 分子。

Frozen or FFPE samples

PrimeScript RT reagent Kit用于分析人子宫肌层与子宫平滑肌瘤(frozen and FFPE samples): Makino, K., et al. Inhibition of uterine sarcoma cell growth through suppression of endogenous tyrosine kinase B signaling. PLoS ONE7, e41049

为了更好地了解子宫平滑肌肉瘤(一种对许多治疗方案具有抵抗力的侵袭性肿瘤)的调节作用,作者评估了脑源性神经营养因子 (BDNF) 和受体酪氨酸激酶 B (TrkB) 及其配体在子宫组织临床样本中的表达。PrimeScript RT reagent Kit(Code No. RR037)用于 qRT-PCR 分析 TrkB 及其配体在子宫肌层和平滑肌瘤的冷冻样本和平滑肌肉瘤的 FFPE 样本中的表达水平。

低拷贝mRNA: 转录因子

PrimeScript Reverse Transcriptase用于分析转录因子的表达: Yamamoto, M., et al. Shared and distinct functions of the transcription factors IRF4 and IRF8 in myeloid cell development. PLoS ONE 6, e25812 (2011).

干扰素调节因子 (IRF) 8 和 IRF4 是控制树突状细胞和B细胞分化的造血细胞特异性转录因子。使用PrimeScript Reverse Transcriptase (Code No. 2680)进行 RT-qPCR,作者研究了 IRF4 和 IRF8 本身的表达模式,以及以前已知受 IRF8 调节的几个巨噬细胞相关基因。

PrimeScript Reverse Transcriptase是一种高灵敏度和高特异性的重组反转录酶,不含RNaseH活性,是Takara公司依据M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus)来源的RTase开发的一种反转录酶。

Takara在PrimeScript反转录酶基础上设计开发了不同功能的试剂盒,总结如下表。

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