他山之石：利用MitoXpress Xtra在分离的线粒体上筛选药物诱导的线粒体功能障碍

线粒体是细胞存亡的功能调节器，与多种疾病密切相关。耗氧量测量是传统评估线粒体功能的首选方法。传统极谱法测量复杂、低通量。本文介绍Agilent MitoXpress Xtra 耗氧量分析试剂盒如何弥补这一缺陷，以多孔板形式实现基于荧光的线粒体耗氧量高通量测定。值得借鉴。来一下头脑风暴！

    线粒体是细胞存亡的功能调节器，因此在许多疾病的病因学中起着重要作用。线粒体功能受损也被认为是药源性毒性的重要原因，因此在制药行业中尤其受到关注。耗氧量测量是传统评估线粒体功能的首选方法。然而，传统极谱法 Clark 型电极方法的测量复杂性和低通量性质限制了这些信息丰富的测量方法的适用性，在用于化合物筛选时更是如此。本文介绍 Agilent MitoXpress Xtra 耗氧量分析试剂盒如何弥补这一缺陷，以 96 或 384 孔板形式实现基于荧光的线粒体耗氧量高通量测定。考虑了关键参数优化并对样品数据进行了描述，解释了如何筛选化合物文库并进行剂量-响应分析。

前言
    线粒体功能障碍与多种疾病的病因有关，也被认为是药源性毒性的主要机制[1-6]。耗氧量分析历来是评估线粒体功能的首选方法，因为这种方法是对电子传递链 (ETC) 活性的直接检测，还能提供偶联的线粒体中关于氧化磷酸化 (OXPHOS) 的特定信息。传统方法利用低通量极谱法对分离的线粒体进行耗氧量测定。然而，该方法不能为平行评估多个实验条件（无论是筛选化合物文库、评估剂量-响应关系，还是分析作用机制）提供所需的通量或便利性。本文介绍 Agilent MitoXpress Xtra 耗氧量分析试剂盒如何将线粒体消耗氧气的速度信息与荧光型酶标仪分析的便捷性和高通量相结合。该方法提供的高通量以及低于常规极谱分析的样品测量体积，表明其可以由单次线粒体制备产生更大的数据集。

    这些功能强大的测量均由 MitoXpress Xtra 探针实现。探针发射光可被分子氧淬灭，由 ETC 活性引起的溶解氧浓度降低，可表现为 MitoXpress Xtra 信号增加。将矿物油添加到每个测试孔形成密封层，以限制环境氧的反向扩散，并通过荧光酶标仪动态测量孔板，以对 ETC 活性进行高通量评估。相对于未处理对照的信号变化率降低表明存在 ETC 活性抑制，而信号增加表明由于 ETC 活性增加或 ETC 与 OXPHOS 的解偶联导致呼吸作用增强。此外，与传统的极谱法一样，使用 ETC 复合物特异性底物可以提供部分有关机制的见解。然而，本文使用的微孔板方法可以平行测量所有相关条件，从而简化了分析设置，数据解析也不会因制备线粒体活性水平的逐渐下降而受到影响。

本文总结了如何进行这些测量，重点关注关键参数优化以及这些测量在化合物筛选和剂量响应分析中的应用

分析条件优化
线粒体蛋白浓度优化
    每毫克线粒体蛋白的耗氧量具有组织特异性，并可受到所用的分离方法影响。耗氧量还受所提供的呼吸底物和 ADP 可用性的影响。为了确保实现稳定分析，必须在已优化的蛋白浓度下筛选化合物，使未处理的样品发生强烈的信号变化，从而可靠地检测活性的增大和减小。与传统的极谱分析法相比，本文采用的微孔板形式（96 和 384）有助于提高通量，使优化更简单。

图 1 为示例数据，在存在和不存在 ADP 的情况下用相关呼吸底物评估了不同蛋白浓度。线粒体蛋白浓度增加使耗氧量增加，实时检测结果表现为更迅速的探针信号增加。如图示，微孔板方法具有的通量可在单个板中评估多个条件。（原图略，详情请索取电子版）

典型的优化蛋白浓度如下：
• 谷氨酸/苹果酸基础呼吸：1 mg/mL
• 利用谷氨酸/苹果酸的 ADP 驱动呼吸：0.125 mg/mL
• 利用琥珀酸的基础呼吸：0.5 mg/mL
• 利用琥珀酸的 ADP 驱动呼吸：0.25 mg/mL

图 1B 显示了利用琥珀酸（孔 E7–H12）进行 ADP 驱动呼吸的蛋白优化信号变化示例。0.25 mg/mL 的浓度显示出快速而可测量的信号变化，是研究可能抑制 ETC 复合物 II–IV 的化合物的理想选择。

    这种优化还有助于评估线粒体偶联，从而可反映线粒体制备质量。可通过确定 ADP 刺激速率（状态 3）与仅底物速率（状态 2）的比例进行上述评估。该呼吸控制比 (RCR) 越高，ETC 活性与 ATP 产生的偶联越好，相反，值越低表明线粒体膜受损越严重。图 1C 中的示例数据显示了添加 ADP 引起的活性增加。

测量线粒体功能干扰
图 2 显示了线粒体功能干扰的典型数据。抗霉素 A 阻断电子传递链的复合物 III，从而抑制氧消耗，而经典的解偶联剂FCCP 消除线粒体膜电位，使耗氧量增加。

对于化合物筛选，筛选解偶联剂时通常在状态 2（无 ADP）下进行测量，筛选抑制剂时则在状态 3（添加 ADP）下进行测量。微孔板形式可显著提高通量，96 和 384 孔形式均可进行测量。这与传统的低通量极谱法截然不同。

图 3 表明如何在单个 96 孔板上重复两次筛选 46 种化合物，在每半边微孔板中平行加入化合物。轻松鉴定出了呼吸作用的显著减少（以绿色突出显示）。

多种化合物的剂量-响应评估也可以方便地在单个板上进行，数据可轻松转换为 IC50/UC50 值，将来自信号曲线的比值数据相对剂量-响应中的浓度作图（图 4B）。然后可以将结果与参考文献或内部数据进行比较。

增加通量
基于 MitoXpress Xtra 的分离线粒体测量与 384 孔板形式兼容，可使通量增加四倍。结合液体处理方法，包括单步384 通道移液器和基本自动化系统，可进一步促进通量的增加。线粒体分离后直接用于检测，无需处理微孔板，分析时间通常约为 30–45 分钟，因此每天或每次线粒体制备可进行多次实验。

材料与方法（方案）

（详情请下载安捷伦 《利用MitoXpress Xtra在分离的线粒体上筛选药物诱导的线粒体功能障碍》 电子版）