Takara IVTpro™ mRNA合成系统重磅上市!

【字体: 时间:2022年06月02日 来源:Takara

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  Takara最新推出了一款专业合成mRNA的IVT反应试剂盒,助力mRNA研发,帮您从无到有,快速组建mRNA合成技术路线!

一款合成高质量mRNA的体外转录(IVT)试剂盒

mRNA是由DNA的一条单链作为模板转录而来的,它在遗传学中心法则中,起到指导蛋白质合成的作用。

mRNA由于其自身优势,可以广泛应用于传染病预防疫苗、肿瘤免疫治疗等等领域,近年来成为生物领域各公司关注的重点,尤其是mRNA疫苗研究日趋火热。mRNA疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和病毒载体疫苗后的第三代疫苗,具有针对病原体变异反应速度快、生产工艺简单、易规模化扩大等特点。其原理是将含有编码抗原蛋白的mRNA导入人体,直接进行翻译形成相应的抗原蛋白,从而诱导机体产生特异性免疫应答,达到预防免疫的作用。

Takara最新推出了一款专业合成mRNA的IVT反应试剂盒,助力mRNA研发,帮您从无到有,快速组建mRNA合成技术路线!

Takara IVTpro™ mRNA Synthesis System(Code No. 6141)是能够简便、高效合成带有Cap结构和Poly(A)序列的mRNA的体外转录试剂盒。它包含以下两种制品(可单独购买):

①  Cloning Kit for mRNA Template(Code No. 6143):用于DNA模板构建

本试剂盒用于将模板DNA无缝克隆到预线性化载体(包含在本试剂盒中)中构建用于体外转录反应的模板质粒。预线性化载体中包含T7 启动子、转录起始序列 (AGG)、5'-UTR(非编码区)、3'-UTR、和105-base Poly(A) 序列。试剂盒还包含用于将目标DNA无缝克隆到预线性化载体的In-Fusion Snap Assembly Master Mix和FLuc对照片段(包括15 bp,3' In-Fusion sequence;FLuc CDS;和15 bp,5' In-Fusion sequence)。

②  Takara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit(Code No. 6144):RNA合成试剂

本试剂盒以含有 T7 启动子序列的双链 DNA 为模板,使用优化的高效T7 RNA聚合酶,通过体外转录可合成大量mRNA。除此以外,还包含用于IVT反应后消化模板DNA的DNase I和用于纯化mRNA的氯化锂 (LiCl) 溶液。真核细胞翻译蛋白质需要RNA的5'端有Cap结构,配合使用CleanCap Reagent AG(TriLink公司的Cap类似物)可以高效制备具有Cap结构的mRNA。

※Cap类似物不包含在本产品中,请另外准备CleanCap Reagent AG (TriLink公司)。

Takara IVTpro™ mRNA合成系统技术路线图:

IVT反应模板制备:

①  使用In-fusion方法,将目的基因克隆到预线性化的模板DNA载体上;
②  Hind III(Code No. 1060A/B)线性化处理模板DNA载体;
③  加入Cap类似物、NTPs,合成mRNA;

DNase I降解模板DNA:

④  DNase I处理产物,去除模板DNA;

mRNA产物纯化:

⑤  氯化锂沉淀法纯化mRNA产物;

后续应用:

⑥  体外翻译 or 转染细胞 or 注射动物

Takara IVTpro™ mRNA合成系统五大优势:

优势No.1:采用In-Fusion无缝克隆,轻松构建模板质粒DNA。

构建参加IVT反应的DNA模板质粒操作非常简单,只需设计好带有In-Fusion序列的目标基因(GOI),即可一步轻松完成模板质粒的构建!

优势No.2:通过体外转录(IVT)反应合成带有Cap结构和Poly(A)序列的mRNA。

为什么要合成带有Cap结构的mRNA?

mRNA的5’端帽子结构(m7GpppN)发现于上世纪70年代,它的存在赋予了mRNA稳定性并使其能够有效翻译。在真核细胞中,除了识别蛋白质合成的起始之外,5’端帽子结构还充当从5’到3’外切核酸酶切割的保护基团。也就是说5’Cap相当于一顶钢盔,保护mRNA不受免疫系统降解,因此Cap结构对于mRNA疫苗研发很重要。本试剂盒配合使用CleanCap Reagent AG(TriLink公司的Cap类似物)可以高效制备具有Cap结构的mRNA。

通过体外转录(IVT)反应合成的 mRNA产量:

此图分别为加入和不加入CleanCap Reagent AG (3'OMe)的情况下,IVT反应溶液中合成Firefly luciferase (萤火虫荧光素酶 ,FLuc) mRNA的产量。由此可见由此可见,Takara IVTpro™ mRNA合成系统兼容CleanCap试剂,使用CleanCap不影响mRNA产量。

优势No.3:优化的T7 RNA聚合酶用于IVT反应,RNA合成效率高、产量大。

使用本产品,每次反应(20 μl 反应体系)可以合成高达 200μg 或更多的RNA。还可以根据需要放大反应体系,即使使用10倍(200μl)反应体系也不影响mRNA预期产量!

IVT反应规模与mRNA产量的关系:

此图为以Positive Control Template(FLuc)为模板,加入 CleanCap Reagent AG (3'OMe) 进行IVT放大实验(除反应液量外均按说明书所述进行)。 由此可见,mRNA 产量与反应体积成正比,并且按比例放大反应溶液体积不会影响mRNA产量。

优势No.4:独立包装的NTPs,方便修饰NTPs替换,且不影响mRNA产量。

剂盒包含独立包装的NTPs,方便优化或使用修饰NTPs(如假尿苷)进行替换,而且不会明显降低mRNA的产量。

为什么要使用修饰的NTPs?

人体免疫系统会识别进入人体的各种物质并将其清除,RNA也不能例外。而人体中本身就有的RNA,却不会被人体免疫系统识别清除,如tRNA。经科学家们研究发现这些tRNA上的尿苷和体外合成实验获得的RNA上的尿苷结构稍有不同,称之为假尿苷。而使用这种修饰的UTP,可以解决mRNA易被免疫系统识别而被清除的问题。

优势No.5:使用氯化锂(LiCl)溶液进行RNA纯化,可立即进行下游应用。

本试剂盒除了提供用于IVT反应后消化模板DNA的DNase I,还提供了用于纯化mRNA的氯化锂 (LiCl) 溶液,纯化效果更加理想! 氯化锂沉淀法纯化RNA与离心柱法进行比较(Fluc mRNA)

在含有CleanCap Reagent AG(3'OMe)和N1-甲基假尿苷的IVT反应溶液中合成FLuc mRNA,并分别通过LiCl沉淀法和离心柱法进行纯化(NucleoSpin RNA Clean-up)。 结果显示,用离心柱法仅一次洗脱(Elution x1)得到的RNA要比LiCl沉淀法要少,但两次洗脱(Elution x2)的RNA量与LiCl沉淀法大致相同。所以使用离心柱法时我们建议进行两次洗脱,而氯化锂沉淀法仅需一次即可。

Takara IVTpro™ mRNA合成系统包含您进行mRNA合成实验时所用到的最基本的工具,是您进行相关研究的理想选择。不管您正在从事于mRNA预防疫苗、治疗疫苗领域还是mRNA治疗药物,您都可以用它来完成您的实验项目!

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