单细胞蛋白质组学高效样品制备方法

单细胞蛋白质组学提供了关于细胞蛋白水平的信息，这可以被证明是有用的抗癌耐药性和细胞分化研究。然而，目前的蛋白质组学方法并不是通用的，往往导致高样本损失。为了克服这个问题，研究人员现在开发了一种新的样品制备方法，称为“油中水滴消化”，以减少样品损失，最大限度的蛋白质鉴定，并与传统方法相比提供更好的灵敏度。

构成我们细胞的蛋白质包含着一个完整的信息世界，这些信息一旦被解锁，就能让我们洞悉许多基本生物现象的起源。这些信息是使用一种被称为“单细胞蛋白质组学”的分析技术来收集的，在这种技术中，单细胞分析被执行，以观察单个细胞在其蛋白质水平上的特征。多年来，科学家将单细胞蛋白质组学应用于癌症基因组学、细胞分化和组织发育等领域。然而，目前的蛋白质组学技术存在蛋白质样品回收率低、通量低、通用性不强等问题。

由日本熊本大学助理教授Takeshi Masuda带领的一组来自日本和美国的研究人员找到了解决这些问题的办法。在一项于2022年7月11日在线发布，并于2022年7月26日发表于《Analytical Chemistry》第94卷第29期的最新研究中，该团队介绍了一种简单而高效的单细胞蛋白质组学样品制备方法，称为“油中水滴法”(WinO)。该技术利用了水与油/有机溶剂的不混溶性，以最小的损失和增加样品回收率的机会制备蛋白质样品。

“为了提高单细胞蛋白质组学的效率，我们要么需要放大蛋白质样本，要么需要确保在样品制备过程中没有任何蛋白质丢失。由于我们没有方法进行前者，所以在样品制备步骤(如样品转移)中减少吸收损失是至关重要的，”Masuda博士解释说。“与传统方法相比，WinO技术不仅减少了通过吸附的样品损失，而且提供了更好的吞吐量。”

在WinO工艺中，研究小组首先将一微升的水与相转移表面活性剂(可增加疏水蛋白的溶解度)和疏水羧基涂层纳米磁珠混合，制备出一种萃取缓冲液。然后将这种混合物倒入50微升的乙酸乙酯中。下一步是蛋白质提取，将细胞分选机中的细胞液滴加入到乙酸乙酯-水滴组合中，在离心机中旋转，使蛋白质在水滴中积累。提取后，样品用蛋白质酶Lys-C消化，并用串联质量标记试剂标记。提取并消化标记样品，然后纯化并回收用于单细胞分析和蛋白质组学分析。

为了比较WinO方法与传统方法的效果，研究小组还使用标准溶液消解(ISD)方法制备样品，并进行蛋白质组学分析。他们发现，与ISD相比，WinO方法使蛋白质和肽的恢复增加了10倍。这一显著的改进归因于减少了萃取液和样品容器之间的接触面积。为了分析两种方法的敏感性，研究小组还比较了获得的蛋白质组谱。他们观察到，使用WinO获得的100个细胞和使用ISD获得的10,000个细胞的蛋白质组学图谱之间存在高度相关性。此外，该团队成功地使用WinO对462种蛋白质进行了定量，证明它比传统技术提供了更高的通量和提取效率。

WinO提供的增强的蛋白质恢复和鉴定能力，可以使我们更近距离地观察癌细胞的蛋白质表达，并更好地理解抗癌药物耐药的机制。此外，WinO可以使用液体处理机器人实现半自动化，使其适合于高速、大容量的样品处理。Masuda博士总结道:“我们的研究可以让科学家对稀少和有限的样本进行蛋白质组学研究，并为蛋白质表达提供一个新的视角，为发现新的生物现象打开可能性。”

Takeshi Masuda, Yuma Inamori, Arisu Furukawa, Maki Yamahiro, Kazuki Momosaki, Chih-Hsiang Chang, Daiki Kobayashi, Hiroto Ohguchi, Yawara Kawano, Shingo Ito, Norie Araki, Shao-En Ong, Sumio Ohtsuki. Water Droplet-in-Oil Digestion Method for Single-Cell Proteomics. Analytical Chemistry, 2022; 94 (29): 10329