【字体: 时间:2025年01月30日 来源:Communications Chemistry 5.9

编辑推荐:

  烯烃和硫醇之间的巯基偶联可以用于蛋白质分析应用中半胱氨酸残基的选择性标记,然而,复杂细胞裂解液混合物的标记尚未得到充分探索。在这里,作者利用紫外、可见波长和氧化还原引发剂,探索了从化学模型到复杂细胞环境的系统中硫醇烯的活化。

蛋白 - 蛋白硫醇 - 烯偶联反应的化学与光激活用于蛋白质分析研究解读


都柏林三一学院化学学院的 André Campani?o 等研究人员在Communications Chemistry期刊上发表了题为 “Chemical- and photo-activation of protein-protein thiol-ene coupling for protein profiling” 的论文。该研究聚焦于蛋白 - 蛋白硫醇 - 烯偶联反应的化学与光激活,对蛋白质分析领域意义重大。此研究拓展了硫醇 - 烯偶联反应在蛋白质研究中的应用,为蛋白质标记和分析提供了多种有效方法,有助于深入探究蛋白质功能,为相关疾病的研究和治疗靶点的发现奠定了基础。


一、研究背景


硫醇 - 烯反应自 1905 年被首次描述以来,已在多个领域得到广泛应用,包括聚合物合成、肽化学、合成化学以及蛋白质标记等。该反应是硫醇与碳 - 碳双键之间的高效反应,能形成硫醚,因其高选择性、高效率和几乎无副产物的特点,被视为 “点击” 反应,适用于半胱氨酸残基的标记。在蛋白质修饰中,泛素化是细胞内关键的蛋白质翻译后修饰过程,泛素通过 E1/E2/E3 连接酶系统添加到底物蛋白上,调节其功能、定位和降解,而泛素从底物上的去除则由去泛素化酶(DUBs)负责。DUBs 家族包含约 100 个成员,其中六个亚家族属于半胱氨酸蛋白酶,利用其活性位点的硫醇催化泛素与蛋白质底物之间异肽键的水解。DUBs 活性的失调与多种疾病相关,如癌症、神经退行性疾病和炎症等。基于泛素的活性位点探针(ABPs)是研究 DUBs 的重要工具,利用 DUB 活性位点的半胱氨酸来标记这类蛋白质。近年来,一种基于烯烃的泛素 - ABP(HA-Ub-alkene probe 1)被开发出来,利用硫醇 - 烯化学可控地激活这种标记。然而,之前使用该探针的研究存在一些局限性,如使用特定引发剂时需要严格的无氧环境,在复杂细胞裂解物混合物中标记效果不佳等。因此,探究硫醇 - 烯偶联反应在不同体系中的激活方式及应用潜力具有重要意义。


二、研究材料与方法


(一)材料


实验中所用的商业试剂和溶剂均购自 Merck、TCI Europe 和 Fluorochem EU 等供应商,无需进一步纯化即可使用。用于化合物纯化的是分析级溶剂,薄层层析(TLC)分析使用预涂有 0.2mm MerckTM KGaA 60 M 硅胶、的铝板,通过 UVP UVGL - 58 灯在 254nm 和 365nm 波长下进行分析,对于无法用 UV 可视化的样品,采用或茚三酮染色。柱色谱使用 MerckTM 硅胶 60(0.040 - 0.063nm)进行。核磁共振(NMR)实验借助 Bruker 400 MHz 系统开展,化学位移以百万分之一(ppm)的 δ 标度表示,以四甲基硅烷为内标,耦合常数(J)以赫兹(Hz)为单位描述,峰的多重性记录为单峰(s)、宽单峰(bs)、双峰(d)、双二重峰(dd)等多种形式。红外(IR)分析利用 Perkin Elmer 分光光度计完成,熔点通过 Griffin 熔点仪测量,电喷雾电离质谱(ESI mass spectra)通过 Bruker microTOFQ III 光谱仪与 Dionex UltiMate 3000 LC 联用在正负极模式下采集。


(二)方法


  1. 化学模型实验:以 N - Boc - L - 半胱氨酸甲酯(2)和烯丙醇(3)作为硫醇 - 烯模型系统,加入不同引发剂(2,2 - 二甲氧基 - 2 - 苯基苯乙酮(DPAP)、4’ - 甲氧基苯乙酮(MAP)、2 - 羟基 - 4′ -(2 - 羟基乙氧基) - 2 - 甲基苯丙酮(Irgacure 2959)、9 - 间三甲苯基 - 10 - 甲基吖啶高氯酸盐(

    )、醋酸锰(

    )),在不同条件下进行反应。反应后通过 TLC 分析监测反应进程,确定产物的生成和原料的消耗情况,反应结束后对产物进行柱色谱纯化,并通过

    NMR、

    NMR、IR 和 HRMS - ESI 等手段对产物进行表征。

  2. 标记研究

    • HA -Ub - MESNa 的表达与纯化:利用含有编码 HA - 标记的

      融合蛋白(含内含肽结构域和几丁质结合结构域)的 pTYB2 质粒转化的 BL21 (DE3) 细胞,在 LB 培养基中培养,通过添加异丙基 - β - D - 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。收集细胞后,经超声破碎、离心等步骤处理,利用几丁质树脂进行亲和纯化,再用 MESNa 洗脱得到 HA -

      Ub - MESNa,最后通过离心浓缩和脱盐处理,使用 Nanodrop 测定最终蛋白浓度。

    • HA -Ub - 烯烃探针 1 的合成:将 N - 羟基琥珀酰亚胺和 Tris - Cl pH 7.5 溶液加入 HA -

      Ub - MESNA 中,在 37°C 孵育 10min 后,加入溶解在乙腈 - 水(1:1)中的烯丙胺,调节 pH 至 10,继续在 37°C 孵育 20h。反应结束后,通过 NAP - 5 柱脱盐、离心浓缩,采用 BCA 法测定蛋白浓度。

    • 体外硫醇 - 烯标记实验:将探针 1 分别与重组 DUBs(OTUB1、OTUB2、USP2、USP7)、牛血清白蛋白(BSA)、β - 半乳糖苷酶或 HEK293T 细胞裂解物在匀浆缓冲液中预孵育 90min,然后加入不同引发剂(DPAP/MAP、Irgacure 2959、

      ),在各自优化的浓度和时间条件下进行反应。反应完成后,加入还原样品缓冲液使蛋白质变性,通过 SDS - PAGE 和银染或抗 HA Western blotting 分析标记情况。


三、研究技术路线


研究人员首先选用不同的引发剂(光引发剂 Irgacure 2959、和氧化还原引发剂),以简单的硫醇 - 烯底物(N - Boc - L - 半胱氨酸甲酯和烯丙醇)构建化学模型,探究不同引发剂在该模型中的反应效率和产物生成情况,重点考察了除氧对反应的影响。接着,针对氧化还原引发剂在化学模型中表现不佳的情况,引入模型酶 OTUB1 构建蛋白 - 蛋白硫醇 - 烯反应模型,研究诱导的硫醇 - 烯烃邻近性对反应的影响。随后,将 HA -Ub - 烯烃探针 1 与 HEK293T 细胞裂解物孵育,利用上述引发剂触发硫醇 - 烯偶联反应,优化反应条件,包括引发剂浓度、光照或孵育时间等,同时考察除氧在复杂生物体系中的作用。最后,在优化条件下,用选定的引发剂处理探针 1 与多种重组 DUBs 以及非 DUB 蛋白(BSA 和 β - 半乳糖苷酶)的混合物,验证引发剂的选择性和标记的结合依赖性。


四、研究结果


(一)初步化学模型研究


  1. 不同引发剂的反应效果:以 DPAP 和 MAP 为引发剂,在标准条件下进行反应,30min 的 UV 照射后,硫醇 - 烯产物 4 的分离产率为 64%。使用 Irgacure 2959 引发剂时,未除氧条件下反应 30min,产物 4 的产率为 18%,除氧后产率提升至 84%,高于 DPAP/MAP 的产率。

    在乙醇中溶解性差,更换为乙腈后,未除氧时无反应发生,除氧后反应 30min,产物 4 的产率为 3%,起始原料 2 的回收率为 95%,若延长反应时间至 6h,产率提高到 12%,起始原料回收率为 85%,计算得到的转化率较高。

    作为氧化还原引发剂,未除氧时主要生成二硫键,产率为 58%,除氧后虽有少量硫醇 - 烯产物 4 生成(产率 3%),但仍有 46% 的二硫键生成。由此可见,Irgacure 2959 和

    在模型系统中表现出较高的产率和良好的转化率,

    虽能催化硫醇 - 烯反应,但二硫键生成较多,不过在蛋白 - 蛋白硫醇 - 烯反应模型中可能具有潜力。

  2. 除氧的关键作用:对于所测试的引发剂,除氧对硫醇 - 烯偶联反应至关重要。除氧显著提高了 Irgacure 2959 的反应产率,使

    能够生成硫醇 - 烯产物,表明除氧可有效促进这些引发剂引发的硫醇 - 烯反应。


(二)与 OTUB1 的额外初步研究


  1. 在蛋白模型中的活性:以 HA -

    Ub - 烯烃探针 1 和重组 DUB OTUB1 为模型系统,研究

    的作用。实验结果表明,在 125μM - 2mM 的

    浓度范围内,均观察到 OTUB1 与 HA -

    Ub - 烯烃探针 1 的显著标记,且 125μM 的

    即可有效触发二者之间的硫醇 - 烯反应。

  2. 蛋白 - 蛋白结合的影响:该结果与化学模型实验中

    的表现差异显著,主要归因于基于泛素的探针 1 与重组 OTUB1 之间的相互作用。在添加

    之前,探针 1 与 OTUB1 孵育,使得泛素基序与去泛素化酶结合,将烯烃弹头定位在有利于硫醇 - 烯反应的最佳位置,蛋白质 - 蛋白质结合后硫醇和烯烃的邻近性促进了高效偶联,说明在诱导硫醇 - 烯烃邻近性的体系中,硫醇 - 烯反应具有不同特性,可能对在化学批量模型中效果不佳的激活方法更敏感。基于此,

    被认为适用于进一步研究,并与 Irgacure 2959 和

    一起用于更复杂的生物混合物研究。


(三)蛋白质分析的硫醇 - 烯系统优化


  1. 光照和除氧的作用:在以 HEK293T 细胞裂解物为模型的实验中,当使用 Irgacure 2959 和

    引发剂时,无光照条件下未观察到标记,光照样品则实现了有效的硫醇 - 烯标记,证实了这两种引发剂的自由基激活是由光触发的,从而实现了对激活步骤的时空控制。对于除氧的作用,Irgacure 2959 除氧后蛋白标记增强,但不除氧也能观察到显著标记;

    在除氧后标记减弱,与化学模型中的观察结果相反。由于所有测试引发剂在不除氧条件下均可实现标记,后续实验除 DPAP/MAP 引发的样品外,均省略除氧步骤,以简化实验流程并提高生物相容性。

  2. 引发剂浓度的影响:测试不同浓度的 Irgacure 2959、

    对反应的影响。Irgacure 2959 在 250μM 时即可实现显著标记,虽 1mM 时标记最强,但为减少过量自由基生成可能导致的蛋白质变性和降解,选择 250μM 作为最佳浓度,且该浓度下引发剂用量比 DPAP/MAP 减少了一半,还无需除氧。

    在 100 - 200μM 浓度范围内标记效果显著,与 DPAP/MAP 相比,在引发剂浓度降低 5 倍且无需无氧环境的条件下仍能实现有效标记。

    在 5mM 及以上浓度才能实现显著标记,是效率最低的引发剂,且在复杂细胞裂解物中所需浓度比与 OTUB1 反应时高 40 倍,不过在该蛋白模型中,氧化还原硫醇 - 烯激活仍取得了成功。

  3. 引发剂孵育时间的影响:优化细胞裂解物中硫醇 - 烯偶联反应的时间条件。Irgacure 2959 在 UV 照射 2min 时标记效果最佳,虽 2 - 5min 的照射对 DUB 标记差异不显著,但为防止蛋白质变性和降解,选择 2min 作为最佳照射时间。

    在 36W 蓝光 LED 照射下,10min 时标记效果最佳;当使用 90W 蓝光 LED 时,2min 即可实现最佳标记,但照射 5min 后出现蛋白质降解现象。

    在 37°C 孵育 60min 时标记效果最佳,但孵育 5min 时标记强度已超过阳性对照,说明虽最佳孵育时间为 1h,但实际标记实验可采用更短的孵育时间。


(四)探针 1 与重组 DUB 和非 DUB 模型的孵育


  1. 引发剂的选择性:在优化条件下,用选定的引发剂(Irgacure 2959、

    )处理探针 1 与三种重组 DUBs(OTUB2、USP2 和 USP7)以及非 DUBs(BSA 和 β - 半乳糖苷酶)的混合物。结果显示,所有引发剂都能成功触发探针 1 与重组 DUBs 之间的硫醇 - 烯偶联反应,产生明显的标记条带;而与 BSA 和 β - 半乳糖苷酶孵育时,未观察到标记,证明了探针 1 对 DUBs 的选择性。

  2. 不同引发剂的标记效率差异

    与 Irgacure 2959 和

    相比,在标记纯化的重组蛋白时可能更高效,产生的标记条带更强。不过,BSA 样品在不同条件下的标记差异被认为是由触发硫醇 - 烯偶联反应的不同条件导致的蛋白质降解引起的。


五、研究结论与讨论


本研究全面探究了硫醇 - 烯偶联反应及其不同激活方法在蛋白质分析中的应用,在化学模型、重组蛋白和复杂细胞混合物中进行了研究,发现不同体系中存在显著差异。在蛋白模型中,烯烃部分与 DUB 活性位点半胱氨酸硫醇之间的诱导邻近性使得硫醇 - 烯加合物的形成比化学模型更快,这使得在化学模型中效率有限的激活方法在蛋白模型中得以应用。紫外线诱导的硫醇 - 烯偶联在化学模型和蛋白模型中效率相似,而可见光和氧化还原激活的引发剂在所有蛋白模型中均显示出强硫醇 - 烯标记,尽管它们在非蛋白模型中效果不佳。此外,激活前蛋白质与探针结合诱导的烯烃和硫醇的对齐克服了对无氧环境的需求,这一优势在生物应用中尤为重要,同时也提高了探针的特异性,减少了与其他硫醇的副反应。


所有引发剂都能成功触发用于 DUB 标记的硫醇 - 烯偶联反应,在重组纯化蛋白和复杂细胞混合物中均有效。综合考虑不同引发剂在不同生物环境中的表现,在纯化的重组蛋白标记中表现最强,最适合用于此类实验;Irgacure 2959 在细胞裂解物实验中表现出色,能在短时间内产生强标记且无需除氧,因此更推荐用于细胞裂解物的检测;因在高浓度和长时间蓝光照射下会导致蛋白质降解,使用受限。


该研究成果验证了硫醇 - 烯偶联激活在简单和复杂蛋白质环境中的多功能性,展示了其在蛋白质分析中的广泛应用潜力,为深入研究蛋白质功能、探索疾病机制以及开发潜在治疗靶点提供了有力的技术支持,推动了蛋白质研究领域的发展。


订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 云展台 | BioHot | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 技术快讯 | 免费试用

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号