揭示E2F1-TFAP2C-SOX17正反馈环路调控特纳综合征生殖干细胞命运的单细胞转录组学研究

《Cell & Bioscience》：Single-cell transcriptomics of organoids reveals transcriptional control of germline stem cell fate by an E2F1-TFAP2C-SOX17 positive-feedback loop in Turner syndrome

本刊推荐：为解决特纳综合征（45,XO）患者不孕症治疗难题，武汉大学团队开展人类生殖系干细胞体外诱导机制研究。通过类器官模型与单细胞转录组学分析，发现生殖系干细胞发育轨迹中E2F1-TFAP2C-SOX17构成的正反馈转录调控环路，揭示E2F1通过激活TFAP2C启动子调控生殖细胞命运决定的新机制，为生殖细胞体外重建提供理论依据。

　　

在女性生殖医学领域，特纳综合征（Turner syndrome）作为最常见的性染色体异常疾病，困扰着约1/2500的女性群体。患者典型核型45,XO（正常女性为46,XX）导致卵巢早期衰竭和不孕症，目前仍缺乏有效治疗手段。更严峻的是，超过10%的特纳综合征妊娠会遭遇自然流产，且伴随心血管异常、骨质疏松等多系统并发症。虽然激素替代疗法可诱导青春期发育，但无法解决生殖细胞缺失这一根本问题。

以往研究表明，特纳综合征胚胎早期卵巢发育正常，但妊娠后期生殖细胞发育异常，导致患者青春期时卵巢仅残留结缔组织条索而无功能生殖细胞。人类原始生殖细胞（hPGCs）作为胚胎发育早期出现的多能生殖干细胞，承担着遗传信息传递的重任，但其在特纳综合征中的发育机制尚未阐明。由于伦理和技术限制，人类胚胎植入期研究困难，使得科学家转向类器官和诱导多能干细胞（iPSCs）模型来破解生殖细胞发育密码。

在此背景下，武汉大学程汉华与周荣家团队在《Cell & Bioscience》发表最新研究，通过构建45,XO特纳综合征患者来源的iPSCs类器官模型，结合单细胞转录组学技术，首次绘制了人类生殖系干细胞发育轨迹，并发现E2F1-TFAP2C-SOX17正反馈转录调控环路在生殖细胞命运决定中的关键作用。

研究人员采用的主要技术包括：①利用45,XO患者羊水细胞来源的iPSCs（由裴端卿教授提供）构建类器官模型；②通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术对类器官细胞进行转录组分析；③CRISPR-Cas9基因编辑技术构建E2F1基因敲除细胞系；④染色质免疫沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告基因实验验证转录因子结合位点；⑤流式细胞术和免疫荧光分析检测hPGCLCs诱导效率。

类器官揭示hPGCLCs及其体细胞微环境

研究团队将45,XO iPSCs诱导为初始中胚层样细胞（iMeLCs）后，通过3D培养形成碗状类器官。流式细胞术检测显示类器官中hPGCLCs（人原始生殖细胞样细胞）比例达19.19%，免疫荧光证实SOX17⁺细胞散在分布于类器官中。单细胞转录组分析鉴定出10个主要细胞簇，包括hPGCLCs、晚期hPGCLCs、前支持细胞、前莱迪格细胞、前颗粒细胞等，表明类器官中同时形成了生殖细胞及其体细胞微环境。值得注意的是，40.7%的SOX9⁺细胞共表达SDF1（基质细胞衍生因子1），KITLG（Kit配体）在内皮细胞簇中表达，这两种因子在小鼠PGC发育和迁移中起关键作用。

hPGCLCs的四个发育状态和谱系

对hPGCLC细胞簇的重新聚类分析揭示了三个发育状态：状态0（粘附连接和ECM-受体相互作用为特征）、状态1（蛋白结合和RNA结合为主）和状态2（细胞周期和DNA复制活跃，E2F1为标志分子）。伪时间分析显示从状态0到状态2的连续发育轨迹。晚期hPGCLCs（簇9）位于发育轨迹下游，表现为SOX17和TFAP2C高表达而BLIMP1和CD38低表达，GO分析显示其显著富集蛋白质翻译和RNA加工过程。

E2F1是hPGCLC特性的关键调控因子

通过CRISPR-Cas9技术构建E2F1敲除的45,XO iPSCs后，发现类器官中生殖细胞标志物（SOX17、BLIMP1、TFAP2C）表达下调，体细胞标志物HOXA1上调。免疫荧光显示E2F1敲除后SOX17和TFAP2C表达几乎消失。流式细胞术检测表明hPGCLCs诱导效率从20.51%显著降低至1.841%，证实E2F1在45,XO类器官hPGCLCs特性中起关键作用。

E2F1在TFAP2C上游发挥作用

分子机制研究表明，E2F1通过结合TFAP2C启动子区两个串联的E2F1结合位点激活其转录。启动子缺失、点突变和荧光素酶实验证实这些结合位点对TFAP2C启动子活性至关重要。染色质免疫沉淀（ChIP）实验证明E2F1在体内结合TFAP2C启动子，ENCODE数据库的E2F1 ChIP-seq数据也验证了这两个结合位点的存在。

SOX17激活E2F1转录建立正反馈环路

研究发现SOX17通过结合E2F1启动子区两个串联的SOX17结合位点激活其转录。启动子分析和ChIP实验证实SOX17在体内结合E2F1启动子。结合已知的TFAP2C对SOX17基因的转录调控作用，研究揭示了E2F1-TFAP2C-SOX17正反馈转录调控环路：E2F1激活TFAP2C转录，TFAP2C激活SOX17转录，SOX17又激活E2F1转录，形成自我强化信号环路，共同促进生殖干细胞命运决定并抑制体细胞分化。

本研究首次在特纳综合征模型中揭示了人类生殖系干细胞的发育轨迹和调控机制，发现了E2F1-TFAP2C-SOX17正反馈环路在生殖细胞命运决定中的关键作用。这不仅为理解特纳综合征生殖细胞发育异常提供了新视角，也为体外重建生殖细胞提供了理论基础。尽管从hPGCLCs到功能性配子的诱导仍面临挑战，特别是如何从诱导系统中鉴定出基因型为23,X而非22,O的卵母细胞，但本研究为解决特纳综合征不孕症问题迈出了重要的第一步。该正反馈环路的发现不仅适用于特纳综合征模型，也可能为健康核型（46,XX和46,XY）的生殖细胞发育机制研究提供新思路，为最终实现生殖细胞体外重建和临床应用奠定基础。