SecB伴侣蛋白维持底物蛋白易位能力的分子机制：单分子FRET与氢氘交换质谱揭示展开酶与保持酶的双重功能

《Communications Biology》：How SecB maintains clients in a translocation competent state

本研究针对细菌分泌蛋白如何维持易位能力这一关键问题，通过单分子FRET和氢氘交换质谱技术，揭示了SecB伴侣蛋白通过"展开酶"和"保持酶"双重作用机制延缓麦芽糖结合蛋白(MBP)折叠的分子过程。研究发现信号肽(SP)和点突变(Y283D)可显著延长SecB结合状态寿命，而SecA能与MBP:SecB复合物形成稳定四元超复合体，进一步维持底物蛋白的非折叠状态。这项研究为理解细菌蛋白分泌系统的质量控制机制提供了重要理论依据。

在细菌的生命活动中，超过500种蛋白质需要通过保守的Sec系统穿越细胞内膜到达目的地才能发挥功能。这些分泌蛋白在细胞质运输过程中必须保持可溶性和非折叠状态，才能顺利通过SecYEG易位子。然而，蛋白质天生具有自发折叠的趋势，这一特性与易位需求形成了根本性矛盾。

对于共翻译分泌途径，这个问题通过将蛋白质合成与易位过程耦合得到了解决。但在翻译后分泌途径中，新生的多肽链只能依靠自身特性和分子伴侣来避免错误折叠或聚集。分泌蛋白在进化过程中获得了延迟折叠的特性：N端信号肽(SP)的添加和促进无序性、降低疏水性的成熟域序列都有助于减缓折叠过程。与伴侣蛋白的关键相互作用能够稳定不稳定的短寿命折叠中间体，有助于维持底物的可溶性和非折叠状态。

在细菌中，分泌伴侣蛋白主要包括：在核糖体上分选新生链的触发因子(TF)；结合新合成前体蛋白以防止过早折叠或聚集的SecB；以及作为Sec易位子马达亚基的SecA。这些伴侣蛋白主要表现出三种活性："展开酶"活性将错误折叠蛋白转化为可折叠状态；"保持酶"活性将底物保持在某一状态，防止折叠或聚集；以及消耗能量的"折叠酶"活性协助底物折叠。

尽管对SecB与模型底物麦芽糖结合蛋白(MBP)的相互作用已有较多研究，但底物蛋白的折叠状态如何影响其与SecB的相互作用，直到底物被传递给易位子的整个过程仍然不清楚。MBP是一个典型的两结构域蛋白，具有不连续的N端和C端结构域。其从尿素中重新折叠时，首先坍塌形成紧凑的熔球态，然后由称为折叠单元(foldons)的协同折叠单元组成的"折叠核心"(FC)驱动形成途径上的折叠中间体，最终转变为天然状态。

为了深入解析SecB如何维持底物蛋白的易位能力，研究人员开展了一项综合性的研究，论文发表在《Communications Biology》期刊上。

研究人员主要运用了单分子荧光共振能量转移(smFRET)和氢氘交换质谱(HDX-MS)两项关键技术。smFRET技术通过在蛋白质特定位点引入荧光探针，实时监测蛋白质折叠过程中的构象变化；HDX-MS技术则能够在近残基水平上描述蛋白质的折叠状态，通过测量氢原子的氘代程度来反映二级结构元素的形成情况。此外，研究还使用了尺寸排阻色谱耦合多角度激光光散射(SEC-MALS)技术来验证蛋白质复合物的形成。实验材料包括MBP的三种变体：成熟结构域(MBP)、带有信号肽的前体形式(proMBP)和慢折叠突变体[MBP(Y283D)]，所有变体都在特定位点(T36C/S352C)引入了半胱氨酸用于荧光标记。

MBP重折叠揭示高FRET中间体

研究发现，天然MBP的FRET分布集中在E_app=0.54，而在8M尿素中展开的MBP呈现低FRET值(E_app=0.16)。稀释展开的MBP后， within seconds，E_app=0.16的未折叠MBP迅速转变为高FRET值的熔球态(MG)，并在几分钟内转变为与天然状态相似的较低FRET分布(E_app=0.54)。带有信号肽的proMBP也通过高FRET MG态进行重折叠，但转变速度比MBP慢。Y283D突变显著延迟了MG向天然状态的转变，延迟时间可达数小时。

通过HDX-MS在近残基水平描述MBP折叠，发现大多数MBP链是高度动态和无序的，除了五个表现出相对高级折叠的区域，这些区域在天然结构中彼此接近，形成了折叠核心。Y283D突变显著改变了蛋白质的折叠核心，废除了靠近突变位点的foldon δ的形成，并对约250个残基上游的foldon γ产生了长程影响。

SecB将客户蛋白保持在扩展状态

在生理浓度(1.6μM)的SecB₄存在下，未折叠MBP稀释后观察到一个新的低FRET群体(E_app=0.24)，代表SecB结合(B)状态。该状态最终以k_app=1.09(±0.02)×10^-3 s^-1的折叠速率转变为E_app=0.54，比无SecB时慢约8倍。信号肽稳定了客户蛋白与伴侣蛋白的相互作用，而Y283D突变体在SecB存在下显示出极长的保持时间，B状态可观察长达24小时，几乎不向天然状态转变。

SecB作为保持酶防止结合客户蛋白的折叠

局部HDX-MS分析显示，当SecB存在于折叠缓冲液中时，MBP链大部分保持无序状态，未观察到foldon的形成。SecB完全阻止了MBP(Y283D)的折叠，将客户蛋白保持在高度无序/动态状态。

SecB可去折叠MBP中间体的折叠核心

研究发现，SecB能够结合MG和FC("爆发相")状态，并在几秒钟内将MG中间体转变为扩展的低FRET B状态。SecB对预先形成的折叠核心具有去折叠活性：加入SecB一分钟后，那些预先形成的元件被去折叠，相同的区域变为完全无序状态。SecB的展开酶活性针对部分形成的foldons。

可溶性SecA与预形成的MBP:SecB4结合形成超复合体

SecA单独存在时对MBP中间体的识别有限，但它特异性识别MBP:SecB并组装成稳定的四元超复合体，进一步稳定客户的易位能力状态。SecA2:MBP:SecB4相互作用依赖于SecA2:Zn²⁺:SecB4相互作用，EDTA螯合Zn²⁺可废除这种相互作用。

研究结论表明，SecB通过结合MBP的MG和FC中间体（而非天然状态），首先作为展开酶去折叠部分折叠的二级结构元件，然后作为保持酶将客户蛋白保持在完全无序状态，缺乏二级或三级结构。信号肽通过提供额外的伴侣蛋白结合位点稳定了客户蛋白:SecB相互作用，而慢折叠突变体通过降低解离速率和消除伴侣蛋白上折叠，增加了SecB的保持酶活性。

这项研究的重要意义在于首次证明了SecB具有展开酶活性，能够去折叠已经形成的结构元件，然后作为保持酶防止新的二级结构形成。SecA与预组装的MBP:SecB4复合物形成稳定的四元超复合体，代表了向易位子靶向的下一步。这些发现为理解细菌蛋白质分泌系统的质量控制机制提供了深入见解，对于开发针对细菌分泌系统的新型抗菌策略具有重要指导意义。研究采用的单分子FRET和HDX-MS方法组合也为研究其他蛋白质折叠和伴侣蛋白系统提供了有力工具。