环化酶发现完成菊类植物环烯醚萜通路，解锁高价值化合物生物合成新路径

《Nature Plants》：Discovery of iridoid cyclase completes the iridoid pathway in asterids

本研究解决了环烯醚萜生物合成中长期缺失的关键环化步骤问题。研究人员通过单细胞测序等技术，在菊类植物中发现并表征了iridoid cyclase (ICYC)，证明其能催化生成7S-cis-trans和7R-cis-cis两种主要nepetalactol立体异构体。该发现完善了iridoid通路，为可持续生产高价值iridoid及其衍生物提供了关键酶学工具。

在植物王国中，菊类植物（asterids）拥有一类被称为环烯醚萜（iridoids）的特殊单萜化合物。这些化合物不仅是植物防御体系的关键组成部分，能够驱赶害虫或吸引益虫，更是多种重要生物碱的前体物质，包括抗癌药物camptothecin和vinblastine、抗疟疾药物quinine，以及潜在的抗成瘾药物ibogaine和催吐剂emetine。尽管环烯醚萜的生物合成途径已被广泛研究，但从线性前体8-oxocitronellyl enol到环化产物nepetalactol的关键步骤始终是科学家们未能破解的谜团。

长期以来，研究人员推测存在一种专门的环化酶负责这一不寻常的化学转化，因为自发环化反应在实验室条件下几乎只产生cis-trans构型，无法解释自然界中广泛存在的7R-cis-cis构型。此外，已知的生物合成酶（GES、G8H、8HGO、ISY）不足以在模式植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）中重建nepetalactol的生物合成。最近在荆芥属（Nepeta）植物中的研究发现了一些特异性蛋白辅助7S-cis-trans nepetalactol的形成，但这些蛋白与菊类植物中的环化机制并无直接关联。

为了解开这个谜题，研究人员对两个系统发育上 distant 的菊类植物成员——Alangium salviifolium（山茱萸目）和Carapichea ipecacuanha（Gentianales目）进行了基因组测序和高分辨率表达分析，并结合单细胞转录组技术，成功鉴定到了环烯醚萜环化酶（ICYC）。这些酶能够催化形成自然界中最常见的两种nepetalactol立体异构体：7S-cis-trans和7R-cis-cis构型。

研究人员发现ICYC属于甲基酯酶（MES）家族的α/β水解酶，虽然这类酶在植物中广泛存在，但此前从未发现其具有非酯酶功能如环化反应。系统发育分析表明ICYC同源物形成了一个独立的进化枝，与所有其他MES分开，表明其具有单系起源。通过体外酶活实验，研究人员证实了ICYC能够与ISY协同工作，显著提高nepetalactol的产率。

这项研究不仅解决了环烯醚萜生物合成途径中长期缺失的关键环节，还为代谢工程提供了新的工具，使得以前难以获得的环烯醚萜立体异构体的大规模生产成为可能，为高价值药物化合物的可持续生产开辟了新途径。

研究团队运用了多种前沿技术手段：对Alangium salviifolium和Carapichea ipecacuanha进行de novo基因组组装；采用组织特异性RNA测序和单细胞转录组学（snRNA-seq）分析基因共表达网络；通过本氏烟瞬时表达系统进行通路重构；利用体外酶活实验验证酶功能；采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）和超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）进行代谢产物检测；通过病毒诱导基因沉默（VIGS）技术在长春花（Catharanthus roseus）中进行基因功能验证；运用split-luciferase assay分析蛋白互作。样本来源于实验室栽培的植物材料。

Identification of ICYC

研究人员通过共表达分析发现，ICYC与已知的iridoid生物合成基因紧密共表达。在C. ipecacuanha的年轻叶片和根茎中，以及A. salviifolium的根中，这些基因表现出高度协同的表达模式。单细胞转录组分析进一步揭示，iridoid途径基因在内部韧皮部相关薄壁细胞（IPAP）中特异性表达，而下游基因则在表皮细胞中表达，这种区室化分布与长春花中的发现一致，表明这种空间组织在iridoid-producing families中是保守的。

In vitro activity assays reveal stereoselectivity of ICYCs

体外实验表明，ICYC与7S选择性的CrISY或7R选择性的AmISY共同孵育时，能分别特异性产生7S-cis-trans或7R-cis-cis nepetalactol。化学氧化和手性GC-MS分析证实了酶促产物的立体构型。所有ICYC同源物都专一性地产生4aS,7aR nepetalactol，而与C-7位的立体化学无关。

ICYC is a member of the MES family

系统发育分析显示ICYC与参与植物激素激活途径和生物碱生物合成的MESs相关。活性位点突变实验表明，催化三联体（S83、D210、H238）中的任何突变都会 abolish 环化酶活性，而其他活性位点残基（V15G和W133A）的突变则导致nepetalactol产量减少。

研究结论表明，ICYC的发现完全解释了7S cis-trans和7R cis-cis nepetalactol衍生iridoids在菊类植物中的主导地位。这项工作清楚地表明，ICYC是从广泛存在的MESs中招募而来，执行这种不寻常的环化反应，并在整个产生iridoids的菊类植物中进化保守。值得注意的是，Nepetoideae中ICYC的明显进化丢失可能促进了荆芥属中不同立体选择性环化酶的趋同进化。

这项研究的重要意义在于：首先，它解决了植物次生代谢研究领域的一个长期难题，完善了人们对环烯醚萜生物合成途径的理解；其次，ICYC的发现为合成生物学提供了新的酶学工具，使得通过代谢工程手段生产各种高价值iridoid化合物成为可能；最后，研究揭示了植物次生代谢途径进化的新机制，为研究植物化学多样性的起源和进化提供了重要见解。该研究成果发表在《Nature Plants》期刊上，为植物天然产物生物合成领域做出了重要贡献。