视黄醇结合蛋白4通过激活NF-κB、JAK/STAT5和JNK信号通路重新激活潜伏HIV-1

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Retinol Binding Protein 4 reactivates latent HIV-1 by triggering canonical NF-κB, JAK/STAT5 and JNK signalling

本研究针对HIV-1潜伏库难以清除的难题，通过系统性筛选人血液肽库，首次发现视黄醇结合蛋白4（RBP4）能够高效逆转HIV-1潜伏状态。研究表明，结合视黄醇的holo-RBP4（而非apo-RBP4）通过激活经典NF-κB通路，并协同JAK/STAT5和JNK信号通路，在生理浓度下显著激活多种潜伏感染细胞模型及ART治疗患者来源细胞中的HIV-1。该发现为"kick and kill"治疗策略提供了新型内源性逆转剂，对HIV-1功能性治愈具有重要意义。

　　

在艾滋病研究领域，最大的挑战是如何清除体内潜伏的HIV-1病毒库。尽管联合抗逆转录病毒治疗（cART）能有效控制病毒复制，但一旦停药，病毒就会迅速反弹。这主要是因为HIV-1能在静息CD4⁺ T细胞中建立潜伏感染，这些细胞携带具有复制能力的前病毒却保持转录沉默状态。当前的各种"shock and kill"策略中，使用的潜伏逆转剂（LRAs）存在效率不足、选择性差、毒性大等问题，且无法有效激活免疫系统清除被重新激活的细胞。

为了解决这一难题，由Chiara Pastorio等研究人员组成的国际团队开展了一项创新性研究。他们通过对人血液肽库进行系统性筛选，意外发现视黄醇结合蛋白4（retinol binding protein 4, RBP4）——一种维生素A的血液运输蛋白，能够强力重新激活潜伏的HIV-1。这一重要发现发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》杂志上，为HIV-1治愈策略提供了新的方向。

研究人员运用了多种关键技术方法：首先通过人血液滤液肽库筛选技术，从384个肽段组分中鉴定出具有潜伏逆转活性的成分；采用MALDI-TOF质谱分析精确鉴定出RBP4蛋白；利用多种HIV-1潜伏感染细胞系（包括J-Lat系列细胞、J1.1、U1和ACH-2细胞）进行功能验证；通过CRISPR/Cas9基因敲除技术和特异性抑制剂处理，解析RBP4激活HIV-1的信号通路机制；使用RNA-seq转录组分析研究RBP4的基因调控网络；最后通过临床样本验证，分析7名长期ART治疗的HIV感染者外周血单个核细胞（PBMCs），使用SIMOA超灵敏检测技术测量HIV Gag-p24蛋白表达，评估RBP4对患者来源潜伏细胞的激活效果。

Identification of RBP4 as activator of latent HIV-1 proviruses

研究人员通过筛选人血液滤液衍生的肽库，发现多个组分能够强烈激活J-Lat 11.1细胞中潜伏的HIV-1报告病毒。经过多步纯化后，质谱分析鉴定出活性成分是分子量约21 kDa的视黄醇结合蛋白4（RBP4），特别是缺乏C末端亮氨酸的RBP4(1-182)变体。活性组分中RBP4浓度与HIV-1再激活程度呈正相关（R²=0.667; p<0.0001），首次将RBP4确定为潜伏HIV-1的有效内源性激活剂。

RBP4 activates latent HIV-1 in a variety of T cell lines

研究发现RBP4能够剂量依赖性地有效激活J-Lat 10.6和11.1细胞系中的潜伏HIV-1前病毒，并在A1、A2和H2 J-Lat Tat GFP报告细胞系中增强GFP表达，同时诱导Jurkat J1.1T细胞克隆中p24的产生。然而，RBP4在J-Lat 6.3、8.4、9.2和15.4细胞系中只有轻微或没有效果，在U937 U1和ACH-2细胞中也未显著刺激p24抗原表达，表明RBP4的激活效果具有细胞类型特异性。

Retinol is required but not sufficient for HIV-1 reactivation

研究发现从血液滤液和血浆纯化的RBP4能有效激活潜伏HIV-1，而重组和尿液来源的RBP4几乎没有活性。重要的是，只有结合视黄醇的holo-RBP4具有激活能力，去除视黄醇后的apo-RBP4完全丧失活性。游离的视黄醇代谢产物（all trans-retinal、retinol和retinoic acid）对HIV-1潜伏逆转效果甚微，且抑制视网膜向视黄酸转化的处理不影响RBP4的激活效果，表明RBP4的潜伏逆转作用不依赖于视黄酸的产生。

Holo-RBP4 induces HIV-1 and NF-κB signaling genes in J-Lat 10.6 but not in 8.4 cells

转录组分析显示，holo-RBP4处理在J-Lat 10.6细胞中诱导了有效的病毒基因表达和有限的细胞基因表达，这些基因主要属于"TNF-α signaling via NF-κB"通路，包括非经典NF-κB通路的关键组分（RELB、BIRC3等）和NF-κB靶基因（CD83、ZC3H12A等）。而在J-Lat 8.4细胞中未引起显著转录变化，表明RBP4在应答细胞中诱导了高度特异性的转录反应。

RBP4-mediated HIV-1 reactivation does not correlate with STRA6 mRNA expression

研究发现在应答和非应答的J-Lat细胞中，STRA6（主要的holo-RBP4受体）mRNA表达水平相似，且J-Lat细胞缺乏TLR4表达。STRA6敲除不影响RBP4介导的HIV-1再激活，表明RBP4通过一个未知受体介导其潜伏逆转作用。

RBP4-induced HIV-1 reactivation involves NF-κB, JAK/STAT5 and JNK signaling

机制研究表明，敲除经典NF-κB信号通路因子（RELA、NFKB1）明显降低HIV-1再激活，而敲除非经典NF-κB通路因子（RELB、NFKB2、NIK）没有或有增强作用。STAT5和JNK抑制剂剂量依赖性地减少RBP4介导的潜伏HIV-1激活，联合使用具有协同抑制效果。这些发现表明RBP4通过激活经典NF-κB通路，并得到JAK/STAT5和JNK信号通路的加强，共同介导HIV-1的潜伏逆转。

RBP4 reactivates latently infected cells derived from PLWH under ART

临床样本分析显示，64名ART治疗的HIV感染者血浆RBP4浓度在10-50μg/mL之间，处于生理浓度范围。对7名病毒抑制的HIV感染者的PBMCs进行ex vivo实验表明，RBP4处理能显著重新激活潜伏的HIV-1（p<0.05），诱导p24蛋白表达，虽然效果低于anti-CD3/28阳性对照，但证实了RBP4在患者来源细胞中的生理相关性。

研究结论和讨论部分强调，holo-RBP4作为血液中维生素A的主要载体蛋白，通过未知受体激活经典NF-κB信号通路，并得到JAK/STAT5和JNK信号通路的协同加强，从而有效逆转HIV-1潜伏状态。这一发现不仅揭示了RBP4在HIV-1潜伏调控中的新功能，还为"kick and kill"治疗策略提供了新型内源性潜伏逆转剂。

研究的重大意义在于：首先，RBP4是血液中含量丰富的天然蛋白，其生理浓度即具有潜伏逆转活性，具有较好的转化应用前景；其次，RBP4通过激活高度特异性的信号通路和转录程序，可能具有较好的安全性特征；第三，这一发现为理解体内HIV-1潜伏库的维持和自发激活提供了新视角，特别是在肥胖、胰岛素抵抗等代谢异常状态下，RBP4水平升高可能影响HIV-1潜伏库的动态平衡。

然而，研究也存在一些局限性，如RBP4的具体受体尚未明确，其在肥胖HIV感染者中对潜伏库的影响需要进一步研究。未来研究将探索RBP4与其他潜伏逆转剂的协同效应，并继续利用体液肽库筛选策略发现更多高效、特异的内源性潜伏逆转剂，为最终实现HIV-1的功能性治愈提供新思路和新工具。