揭示橄榄叶多酚提取物在糖尿病相关内皮功能障碍中的抗炎潜力：Picual与Changlot Real品种的比较研究

本研究深入探讨了两种西班牙橄榄叶单品种（Picual与Changlot Real）多酚提取物在糖尿病相关内皮炎症模型中的抗炎作用。通过HPLC-ESI-TOF-MS表征提取物成分，并利用健康妊娠（C-HUVEC）和妊娠糖尿病（GD-HUVEC）来源的人脐静脉内皮细胞模型，发现两种提取物均能显著抑制NF-κB p65磷酸化、MCP-1基因表达及VCAM-1蛋白表达，并降低单核细胞黏附。研究为橄榄叶多酚调控NF-κB–VCAM-1轴、缓解糖尿病血管并发症提供了新的实验依据。

　　

引言

糖尿病是一种严重的代谢性疾病，与由内皮功能障碍、慢性炎症和氧化应激驱动的血管并发症密切相关。迫切需要新的策略来减轻内皮激活。在此背景下，源自橄榄叶的酚类化合物（橄榄油生产的副产品）在对抗糖尿病相关内皮炎症方面显示出潜在潜力。本研究调查了来自两个西班牙橄榄叶单品种Picual和Changlot Real的多酚提取物在健康妊娠（C-HUVEC）和妊娠糖尿病（GD-HUVEC）的人脐静脉内皮细胞中的抗炎作用，该模型作为高血糖诱导内皮功能障碍的相关体外模型。

方法

通过HPLC-ESI-TOF-MS对橄榄叶提取物进行表征。用提取物处理C-HUVEC和GD-HUVEC，并在基础和TNFα刺激条件下使用RT-PCR、流式细胞术和黏附试验评估促炎标志物表达（NF-κB p65、MCP-1和VCAM-1）、NF-κB p65磷酸化和单核细胞黏附。

结果

Picual和Changlot Real提取物在浓度高达50 mg/mL时均无细胞毒性。用10 mg/mL的两种提取物处理显著降低了NF-κB p65和MCP-1基因表达以及NF-κB p65磷酸化，尤其在GD-HUVEC中。VCAM-1蛋白表达和TNFα诱导的单核细胞黏附在提取物处理后也显著降低。值得注意的是，Changlot Real在两种细胞类型中表现出更广泛的抗炎作用，而Picual在GD-HUVEC中发挥更选择性作用。

讨论

这些发现支持了橄榄叶多酚的抗炎活性，并强调了Changlot Real和Picual提取物在减轻糖尿病相关内皮功能障碍方面的潜力。通过调节NF-κB–VCAM-1轴，这些化合物可能减轻内皮激活，值得进一步研究它们在预防或减轻糖尿病相关血管并发症中的可能作用。

橄榄叶样品

Changlot Real和Picual品种的橄榄叶样品由西班牙科尔多瓦的“IFAPA, Centro Alameda del Obispo”提供。两个样品在相同的农艺和环境条件下在同一橄榄园中种植，叶子于7月收集。

酚类化合物的提取及其通过HPLC-ESI-TOF-MS的分析

根据Talhaoui等人的方法，用80/20 v/v的甲醇/水提取0.5 g干叶。提取物用50/50 v/v的甲醇/水重构，并通过HPLC-TOF-MS进行分析。使用Agilent 1200 HPLC系统 coupled to a QTOF Agilent 6520 B mass spectrometer，使用Talhoui等人报告的柱和色谱条件进行目标化合物的测定。

脐带捐赠者和新生儿的临床特征

脐带从随机招募的健康高加索母亲（对照组，C）和妊娠糖尿病（GD）妇女在妊娠第三季度获得，并在意大利佩斯卡拉的Hospital Santo Spirito的“糖尿病与妊娠诊所”随访直至分娩。

GD妇女仅接受饮食治疗，排除孕前糖尿病妇女。所有程序均符合《赫尔辛基宣言》原则和机构人体实验委员会的伦理标准。经机构审查委员会批准方案后，获得每位参与者的签署知情同意书。对照组（n = 4）和GD（n = 4）妇女捐赠者及新生儿的特征如表1所述。按年龄和体重指数（BMI）匹配的妇女分为两组，一组为正常血糖/健康对照组（基础血糖<5.1 mmol/L，口服葡萄糖耐量试验（OGTT）1小时<10 mmol/L和OGTT 2小时<8.5 mmol/L，n = 4），另一组诊断为妊娠糖尿病（基础血糖≥5.1 mmol/L，OGTT 1小时≥10 mmol/L，OGTT 2小时≥8.5 mmol/L，GD，n = 4），根据美国糖尿病协会标准。

HUVEC分离和培养

从在意大利基耶蒂和佩斯卡拉医院分娩的37至40孕周新生儿脐带中分离原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。捐赠者为随机选择的高加索母亲，诊断为妊娠糖尿病（GD）或作为健康对照（C），遵循先前建立的协议。

简要地，分娩后立即收集脐带，静脉插管并用1 mg/mL胶原酶1A在37°C酶解。 resulting HUVEC分离并在由DMEM/M199（1:1）组成的基础培养基中培养，补充1% L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素和20%胎牛血清（FBS）。在1200 rpm离心10分钟后，将细胞 pellet 重悬于相同培养基中，并铺在1.5%明胶包被的培养瓶上。

通过内皮标志物如von Willebrand因子、CD31和CD34的表达以及 upon pro-inflammatory stimulation 诱导 adhesion molecules（ICAM-1、VCAM-1和E-selectin）和 cytokines（IL-6和IL-8）的表达确认HUVEC的表型特征。功能验证显示它们在Matrigel上形成毛细血管样结构的能力。值得注意的是，GD-HUVEC formed less interconnected tubes with fewer segments, meshes, junctions, and nodes compared to controls， confirming impaired angiogenic capacity。

此外，GD-HUVEC showed a stable pro-inflammatory phenotype caused by epigenetic modifications acquired during in vivo hyperglycemia exposure。 Accordingly, in this study GD-HUVEC demonstrated a significant upregulation of NF-kB p65 gene expression and VCAM-1 protein expression compared to control cells。用于实验的细胞培养在3至5代之间， never exceeded passage 5。对于 assays，HUVEC维持在1.5%明胶包被的板上，在完全内皮生长培养基中，由低葡萄糖（1 g/L）DMEM和M199（1:1）组成，补充10 mg/mL肝素、50 mg/mL内皮细胞生长因子（ECGF）、20% FBS、1%青霉素/链霉素和1% L-谷氨酰胺。

所有实验在技术重复中进行，使用至少三个独立捐赠者 per group（对照组和GD，n = 3）的HUVEC。TNFα暴露时间选择以反映NF-κB cascade的 temporal dynamics：1小时捕获快速p65磷酸化，6小时监测转录激活，16小时评估晚期功能效应如VCAM-1表面表达和 leukocyte adhesion。

MTT试验

在对照妇女和诊断为妊娠糖尿病的妇女分离的HUVEC上进行实验，遵循先前建立的协议。为了确定多酚提取物Picual和Changlot Real对C-和GD-HUVEC活力的影响，进行了3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）试验。HUVEC以5.600 cells/cm2的密度接种在96孔板中。用 increasing concentration of extracts（0.1-100 μg/mL）处理24小时后，细胞在37°C与5 mg/mL溶解在PBS中的MTT孵育3小时。此后，通过加入DMSO（每孔200 μL）和 gentle shaking 30分钟溶解MTT晶体。最后，使用微孔板分光光度计系统记录每个样品在540 nm的吸光度。

RNA提取和实时定量PCR

使用TRIzol试剂协议从用10 μg/mL Picual和Changlot Real多酚提取物处理的HUVEC中分离和提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计评估回收RNA的定量。使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit合成cDNA。使用TaqMan Universal Master Mix II和TaqMan Gene Expression Assay probes for human NF-κB p65、MCP-1和RPLP0 according to the manufacturer’s instructions。所有样品在技术重复中分析。使用2^-ΔCt方法计算目标基因的相对表达，使用RPLP0作为内参。

免疫荧光分析

HUVEC用3%甲醛在室温固定20分钟。然后移除甲醛，用PBS洗涤5分钟两次，并用0.1% Triton X-100在PBS中透化10分钟。细胞用1%牛血清在PBS中在室温封闭1小时。随后，细胞与一抗NF-κB p65孵育1小时。用PBS洗涤后，细胞与Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibody和Phalloidin在室温孵育1小时。细胞核用DAPI mounting medium染色。最后，用PBS洗涤细胞，并用Fluorescence Mounting Medium封片。为了获取免疫荧光信号，在共聚焦显微镜下观察载玻片。

流式细胞术分析

使用BD FACS Canto II流式细胞仪进行流式细胞术分析。具体地，使用FACSDiva v 6.1.3、IDEAS software分析每个样品1×10⁴ events。细胞用多酚提取物预处理24小时，随后在有或没有TNFα（10 ng/mL）的情况下孵育16小时以评估VCAM-1蛋白表达，孵育1小时以评估NF-κB p65及其磷酸化形式 phospho-NF-κB p65 S536。为了确定蛋白表达，细胞使用Intrasure kit透化，处理，并与一抗孵育30分钟在4°C。随后与Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibody孵育30分钟在4°C以评估NF-κB p65和 phospho-NF-κB p65表达。所有结果表示为平均荧光强度（M.F.I.）比率，通过将阳性事件的M.F.I.除以阴性事件的M.F.I.计算。

单核细胞黏附试验

对照和GD-HUVEC在六孔组织培养板中用10 μg/mL浓度的多酚提取物Picual和Changlot Real预处理24小时，用0.1% FBS饥饿2小时，并用或不用TNFα（10 ng/mL 16小时）作为炎症刺激处理。简要地，1×10⁶ U937细胞与HUVEC在旋转条件下在室温共培养。20分钟后，用PBS移除非黏附细胞，单层用1%多聚甲醛固定。使用倒置光学显微镜获取图像。使用ImageJ software确定四个独立实验中黏附细胞的数量。

统计分析

所有实验数据表示为平均值±标准差（SD）。每个实验在技术重复中进行，使用至少3个独立捐赠者的C-和GD-HUVEC。通过Shapiro–Wilk test评估定量数据的正态分布。使用 one-way ANOVA test followed by Tukey’s test进行多重比较。概率值计算考虑95%兼容区间。所有分析使用GraphPad Prism进行。

橄榄叶提取物中酚类化合物的测定

两个研究样品的酚类含量如表2报告。通过HPLC-ESI-TOF-MS在两种橄榄叶提取物中鉴定和定量了总共36种酚类化合物，来自 secoiridoids、 flavonoids、 simple phenols、 oleosides和 elenolic acids。Changlot Real显示出比Picual更高的酚类化合物含量。正如预期，secoiridoids是两种栽培品种的主要酚类（65.7-79.5%），oleuropein是第一种化合物，占酚类含量的53.5%以上。Flavonoids在Changlot Real和Picual中占总酚类化合物的6%至12%。Simple phenols（tyrosol和hydroxytyrosol衍生物）在两种栽培品种中占 less than 1.6%。Oleosides为10%至15%，最后，elenolic acids占总酚类化合物的3.5%至6%。这些数据与Talhoui等人先前的数据一致。

酚类提取物Picual和Changlot Real对细胞活力的影响

为了评估可能的细胞毒性，测试了来自Picual和Changlot Real橄榄叶的多酚提取物，使用MTT试验在GD-HUVEC和C-HUVEC上。细胞用四种不同浓度的提取物（0.1、1、10和100 μg/mL）处理24小时， prepared in DMSO并以最终DMSO浓度0.05%加入培养基中。在所有实验中包括 vehicle-matched controls。结果显示在任何浓度下细胞活力没有显著变化，表明两种提取物在测试条件下良好耐受且无细胞毒性。

酚类提取物Picual和Changlot Real对NF-κB p65和MCP-1 mRNA水平的影响

为了评估和比较Picual和Changlot Real多酚提取物的可能抗炎作用，在不同条件下检测了HUVEC中促炎基因NF-κB p65和MCP-1的表达水平。正如预期，NF-κB p65和MCP-1基础表达在GD-HUVEC中略高于对照。通过使用 vehicle-matched controls选择最佳浓度后，细胞用10 μg/mL Picual和Changlot Real多酚提取物预处理。结果显示两种提取物导致NF-κB p65和MCP-1基因表达减少，在GD-HUVEC中效果更明显。在GD-HUVEC中，在没有促炎刺激的情况下也观察到减少， though not statistically significant。用TNFα（10 ng/mL）刺激6小时显著上调了C-HUVEC和GD-HUVEC中的NF-κB p65和MCP-1，表明 robust inflammatory response。然而，用Changlot Real多酚提取物处理有效 counteracted this effect，显著减少两种细胞类型中两种基因的表达。类似地，Picual处理也下调了NF-κB p65和MCP-1表达；然而，其效果更明显并在GD-HUVEC中达到统计显著性。这些发现表明两种酚类提取物可能发挥抗炎作用，Changlot Real在测试细胞条件下显示出更广泛的影响，而Picual似乎在GD-HUVEC中 primarily 有 marked effect。

酚类提取物Picual和Changlot Real对NF-κB p65磷酸化的影响

为了进一步研究Picual和Changlot Real酚类提取物的抗炎作用，在C-和GD-HUVEC中评估了NF-κB p65在Ser536的磷酸化。在基础条件下，NF-κB p65磷酸化在GD-HUVEC中相对于对照细胞似乎 modestly elevated， though this difference was not statistically significant。 Upon TNFα stimulation，在两种细胞类型中检测到NF-κB p65磷酸化的显著增加。用Picual酚类提取物预处理导致在TNFα刺激的C-HUVEC和GD-HUVEC中NF-κB p65磷酸化的显著减少趋势。类似地，用Changlot Real多酚提取物预处理有效 counteracted TNFα诱导的NF-κB p65磷酸化在两种细胞类型中，在GD-HUVEC中效果更明显且统计显著。这些发现与NF-κB p65核转位一致，并表明两种酚类提取物的抗炎作用可能通过NF-κB pathway downregulation介导。

酚类提取物Picual和Changlot Real对VCAM-1蛋白表达的影响

为了进一步研究NF-κB p65介导的 pathway，在用或不用TNFα刺激的用Picual和Changlot Real酚类提取物处理的C-和GD-HUVEC中研究了VCAM-1蛋白表达，一种强烈调节内皮炎症的主要下游分子。GD-HUVEC exhibited a significantly increased basal VCAM-1 protein expression compared to control cells confirming their pro-inflammatory phenotype。有趣的是，用Picual和Changlot Real提取物处理导致GD-HUVEC中VCAM-1表达减少；然而，这种减少没有达到统计显著性。正如预期，TNFα刺激显著增加了两种细胞类型中的VCAM-1表达，在GD-HUVEC中效果更明显。此外，用 both Picual和Changlot Real酚类提取物预处理引起在TNFα诱导的VCAM-1表达在C-和GD-HUVEC中的显著减少， mostly in the latter one。这些发现提供了Picual和Changlot Real提取物在调节内皮炎症中 possible capacity的额外证据。

酚类提取物Picual和Changlot Real对U937单核细胞–HUVEC相互作用的影响

为了评估酚类提取物Picual和Changlot Real在功能相关背景中的体外潜在抗炎作用，进行了单核细胞黏附试验。该试验密切模拟在病理条件下如动脉粥样硬化中观察到的血管炎症的早期阶段。如所示，用Changlot Real酚类提取物预处理24小时显著减少了TNFα刺激的单核细胞黏附到 both C-HUVEC和GD-HUVEC， strongly supporting its anti-inflammatory effect on the endothelium。用Picual酚类提取物预处理24小时导致在C-HUVEC中TNFα刺激的单核细胞黏附减少， although this reduction was only statistically significant in GD-HUVEC， supporting its selective effect in the diabetic-like endothelial model。

讨论

这项研究证明了来自Picual和Changlot Real单品种橄榄叶的酚类提取物的抗炎潜力，专注于它们对来自妊娠糖尿病母亲新生儿脐带的内皮细胞体外模型的影响，因此暴露于体内高血糖。通过HPLC-ESI-TOF-MS彻底表征提取物，揭示了丰富多样的酚类组成。特别是，Changlot Real表现出比Picual更高的总酚类含量，尤其是在secoiridoids中，以其强生物活性而闻名。这些结果与先前的报告一致，如Talhoui和合作者，确认了oleuropein作为主要成分的优势。

妊娠糖尿病来源的内皮细胞（GD-HUVEC）模型代表了一个有价值的体外系统，用于研究慢性高血糖对内皮功能的影响。在高血糖子宫环境中发育，这些细胞表现出分子和功能改变， mirror diabetes-associated vascular dysfunction，包括由表观遗传修饰驱动的变化。这使得GD-HUVEC成为一个相关模型，以研究 underlying endothelial impairment的机制，如由 prolonged high glucose exposure引起的炎症。与我们之前的发现一致，我们确认了GD-HUVEC和对照内皮细胞（C-HUVEC）在 both NF-κB p65 gene expression and VCAM-1 protein levels方面的基线差异，内皮炎症通路的关键调节因子。

我们的数据表明，Picual和Changlot提取物在 wide range of concentrations（0.1–50 μg/mL）对内皮细胞无毒。 both control（C-HUVEC）和妊娠糖尿病来源的内皮细胞（GD-HUVEC）的细胞活力 upon treatment保持稳定，证明这些提取物不损害细胞完整性。这一发现对于潜在治疗应用至关重要，因为它确认测试的多酚可以在这些浓度下使用，而不会对内皮细胞活力产生 adverse effects。

在分子水平上，橄榄叶提取物的抗炎作用通过 key inflammatory markers的一致下调得到证明。具体地，用 both Picual和Changlot Real预处理显著减少了在基础和TNFα刺激条件下的NF-κB p65和MCP-1基因表达。有趣的是， while Changlot Real showed a broader inhibitory effect across both control and GD-HUVEC， Picual exerted a more pronounced action exclusively in GD-HUVEC，我们之前已经显示其表现出由于糖尿病环境诱导的表观遗传改变引起的炎症表型。这表明两种单品种之间在生物活性化合物 profiles or bioavailability方面的潜在差异，可能 linked to the higher phenolic content in Changlot Real。

有趣的是，两种提取物减弱了NF-κB p65在Ser536的磷酸化，NF-κB信号 cascade中的关键激活步骤，尤其是在TNFα刺激下。这种抑制效应在GD-HUVEC中更显著， reinforcing the notion that these cells are particularly responsive to polyphenol treatment and that the extracts may be especially effective in pathological conditions associated with endothelial dysfunction。

下游NF-κB，VCAM-1，一种在血管炎症期间 involved in monocyte recruitment的关键黏附分子，也在用两种提取物处理后下调。再次，Changlot Real和Picual更有效地减少GD-HUVEC中的VCAM-1表达， even under basal conditions， indicating a preventive anti-inflammatory effect beyond the response to external stimuli。类似结果最近报道使用橄榄叶提取物及其酚类、oleuropein和hydroxytyrosol，以抑制LPS诱导的VCAM-1表达和单核细胞黏附在人冠状动脉和脐内皮细胞中。

功能上，这种分子调制转化为减少的单核细胞黏附到内皮，动脉粥样硬化发生中的早期关键步骤。Changlot Real显著 decreased TNFα-induced monocyte adhesion in both control and GD-HUVEC， while Picual exerted a comparable effect exclusively in GD-HUVEC。集体上，这些结果确认了两种提取物的抗炎活性，并表明在糖尿病样条件下潜在的疾病修饰效应， characterized by sustained oxidative stress and low-grade inflammation。

综上所述，这些数据表明Picual和Changlot Real橄榄叶提取物通过NF-κB pathway发挥其抗炎作用，减少 both transcriptional and post-translational activation steps，并最终限制单核细胞招募。用Changlot Real观察到的更强和更广泛的效果可能归因于其更高的酚类化合物含量，特别是secoiridoids，已知调节氧化和炎症通路。支持这一点，对特级初榨橄榄油和相关补充剂的研究一致报告在人类中 inflammatory cytokines and soluble adhesion molecules的剂量依赖性减少， reinforcing the relevance of our in vitro findings。进一步证实这些结果，我们最近的工作证明，oleanolic acid，一种 abundant in olive leaves and oil的生物活性三萜类，降低关键炎症黏附分子（VCAM1、ICAM1、SELE）的表达，减少单核细胞黏附，并恢复来自妊娠糖尿病妊娠的内皮细胞中的血管生成功能和迁移， highlighting its potential to counteract hyperglycemia-induced endothelial dysfunction via epigenetic mechanisms。此外，我们的体外发现与先前的体内研究一致，证明橄榄叶提取物（OLE）在改善系统炎症和血管功能障碍中的有益 effects。例如，在老年大鼠中OLE补充改善了内皮功能和代谢参数，包括促炎标志物如TNF-α和IL-6的减少， together with enhanced antioxidant gene expression， highlighting its protective role against age-related vascular decline。 Moreover, in a model of high-fat diet-induced obesity， OLE not only improved glycemic control and lipid profiles but also reduced systemic and adipose tissue inflammation， restored gut microbiota composition， and reversed endothelial dysfunction， indicating its multifaceted therapeutic potential in cardiometabolic diseases。这些体内数据强烈支持我们当前的观察，并进一步 underscore the translational relevance of OLE， particularly in pathological settings characterized by chronic inflammation and endothelial impairment。此外，认识到药代动力学、生物利用度和安全性对于治疗应用的重要性，先前的毒理学研究确认了Olea europaea叶提取物的安全性。对关键多酚如oleuropein和hydroxytyrosol的生物利用度和代谢的调查提供了它们在人类中系统活性的证据。临床试验也报告了OLE补充后胰岛素敏感性的改善，和 herb-drug interaction studies suggest its safe use alongside antihypertensive medications。

总之，我们的 pilot in vitro study表明，Picual和Changlot Real橄榄叶多酚可能调节NF-κB–VCAM-1轴并减少内皮炎症和单核细胞黏附。观察到的Changlot Real的更强效果表明，具有更高酚类含量的单品种提取物可能具有潜在相关性，以供进一步研究在预防或减轻糖尿病血管并发症中。

这项研究的结果与先前的发现一致，并表明单品种橄榄叶多酚，特别是来自Changlot Real的，可能提供一种有前景的自然且无毒的方法来减少内皮炎症，尤其是在糖尿病相关血管并发症的背景下。然而，我们工作的一个显著限制是无法评估性别对后代结果的潜在影响， since several studies have suggested that sex differences can affect metabolic responses and long-term health during gestational diabetes。这一方面值得进一步调查。还应考虑，我们的证据目前限于体外观察，并且详细的植物化学分析 individual bioactive constituents超出了本研究的范围。未来的研究将专注于全面的化学表征和剂量反应分析，以更好地定义活性成分并阐明其作用机制。此外，涉及更大样本量、体内模型、临床试验和适当阳性药理控制的进一步调查对于确认这些初步发现和澄清所涉及的分子通路至关重要。