Gfr摄取系统为鼠伤寒沙门氏菌SL1344在肠道初始定植阶段提供环境依赖性的适应性优势

本综述深入探讨了鼠伤寒沙门氏菌（S. Tm）利用美拉德反应产物——果糖赖氨酸（FL）的Gfr摄取系统，揭示了其在突破肠道定植抗性（CR）中的关键作用。研究通过体内外实验证明，FL作为一种“私有营养源”，其利用效益高度依赖于肠道菌群的代谢背景和营养环境，为理解饮食-微生物-病原体互作提供了新视角。

　　

2.1 S. Tm的gfr基因是其在小鼠肠道腔初始生长所必需的

前期在低复杂度菌群（LCM）小鼠中进行的随机条形码转座子测序（RB-TnSeq）筛选发现，S. Tm SL1344的基因gfrA (SL1344_4465) 和gfrB (SL1344_4471) 对于定植至关重要。这些基因是gfrABCDEF操纵子的一部分，该操纵子编码一个甘露糖家族磷酸转移酶系统（PTS），负责果糖赖氨酸（FL）和葡萄糖赖氨酸（GL）的摄入和降解。

为了验证这些发现并评估操纵子中其他基因的功能，研究团队在S. Tm SL1344中构建了gfrA、gfrB、gfrD、gfrE、gfrF的单基因框内缺失突变体，以及一个缺失整个gfrABCDEF操纵子的突变体（Δgfr）。每个菌株都用独特的DNA条形码（WITS标签）进行标记，以便通过qPCR量化其在竞争中的适应性。

用野生型（WT）与各突变体的等量混合物口服感染LCM小鼠后，通过监测粪便中的竞争指数（C.I.）发现，ΔgfrA突变体的适应性衰减最为显著，感染后第1天（p.i.）C.I.降至0.1–0.01，到第4天进一步降至0.001。其他突变体（ΔgfrB, ΔgfrD, ΔgfrE, ΔgfrF, Δgfr）在第1天也出现约3-10倍的衰减（C.I.≈0.1）。ΔgfrA的严重表型可通过在其天然启动子下用质粒回补野生型gfrA而得到挽救，证实其表型特异性由gfrA缺失引起。推测EIIA酶（由gfrA编码）可能在其他PTS系统中具有额外功能，例如调节毒力或避免有毒中间产物的积累。

该操纵子提供的适应性优势具有环境依赖性。在无菌（GF）小鼠或经链霉素预处理的SPF小鼠中，由于单糖等营养丰富，ΔgfrA突变体的适应性衰减不明显（在GF小鼠中C.I.≈1）。这表明，在营养稀缺的竞争环境中，FL或GL的利用对S. Tm的初始生长尤为重要。

2.2 果糖赖氨酸存在于小鼠饲料和小鼠肠道中

美拉德反应产物（如FL和GL）主要在食物加热过程中形成，宿主无法吸收，预计会在肠道腔内积累。质谱分析证实，在经高压灭菌的小鼠饲料颗粒以及未感染LCM小鼠的肠道内容物中均检测到了FL的存在。由于GL的化学合成会产生大量副产物，且此前报道显示GL是S. Tm 14028的不良营养源，因此研究重点集中在FL上。

2.3 补充果糖赖氨酸不能增强沙门氏菌在肠道中的生长

研究进一步探讨了通过灌胃或饮水额外补充FL是否能在SPF或LCM小鼠中增强S. Tm的生长或破坏定植抗性。然而，在感染前给SPF或LCM小鼠单次灌胃不同剂量（66 mg或120 mg）的FL，或在其饮水中持续提供1%的FL，均未观察到S. Tm粪便载量的显著增加。结论是，小鼠饲料中已有的FL含量已足够，在实验条件下，S. Tm的进一步生长受到其他限制性因素的制约。

2.4 果糖赖氨酸是厌氧条件下S. Typhimurium SL1344的碳源和氮源

尽管FL在好氧条件下可作为大肠杆菌（E. coli）和S. Tm 14028的碳氮源，但其对SL1344在厌氧条件下的支持能力尚不清楚。在以富马酸盐作为关键电子受体的厌氧最小培养基（M9）中，野生型S. Tm和ΔgfrE突变体在以FL作为唯一碳源时生长显著减缓（最终OD₆₀₀≈0.15），而ΔgfrA敲除菌株则完全不生长，证实了gfrA在FL利用中的关键作用。出乎意料的是，缺失deglycase基因gfrF的突变体仍表现出残余生长，暗示GfrE可能存在底物宽泛性，或其他替代酶可以切割果糖赖氨酸-6-磷酸。

当FL作为唯一氮源时（以丙酮酸作为额外碳源），所有菌株的生长均较差，表明FL是一种相对低效的氮源。¹³C标记示踪实验（使用果糖部分全标记、赖氨酸部分未标记的FL）表明，FL的果糖部分碳原子通过糖酵解和磷酸戊糖途径被完全利用，而内源性赖氨酸则未被标记，说明FL中的赖氨酸部分可直接用于蛋白质合成，而非用于从头合成赖氨酸。

2.5 果糖赖氨酸为蛋白质生物合成提供赖氨酸构建块

铵盐（NH₄Cl）和天冬酰胺（Asn）是S. Tm的首选氮源，FL作为氮源的效果较差。有趣的是，直接补充L-赖氨酸支持的厌氧生长甚至比FL更差。为了检验FL是否能挽救赖氨酸营养缺陷，研究人员分析了赖氨酸营养缺陷型突变株（ΔlysA）在补充FL或L-赖氨酸的培养基中的生长情况。在好氧条件下，FL能以剂量依赖的方式挽救ΔlysA突变体的生长，但在较低浓度（0.1–1.0 mM）下，L-赖氨酸的效果优于FL。

体内竞争实验表明，赖氨酸是肠道中的限制性营养。缺失主要赖氨酸转运蛋白LysP的突变体（ΔlysP）在OligoMM¹²小鼠中严重衰减（C.I.: 0.1），而缺失其他转运蛋白（ArgT, CadB）或赖氨酸分解代谢酶（LdcC, CadA）的突变体则生长正常。此外，赖氨酸生物合成（ΔlysA）也至关重要（C.I.: 0.01）。在缺失所有三个赖氨酸转运蛋白的突变体（ΔlysP ΔcadB ΔargT）中，进一步删除gfr操纵子（Δgfr ΔlysP ΔcadB ΔargT）会导致其在感染初期适应性进一步下降，这表明GL/FL的利用有助于补充细胞内的L-赖氨酸池。

2.6 S. Tm和大肠杆菌在肠道中竞争果糖赖氨酸

在LCM小鼠的肠道内容物中检测到FL，且生物信息学分析表明LCM菌群成员中缺乏高置信度的gfr或其他已知的FL利用酶的同源物，这意味着LCM microbiota缺乏强效的FL消费者。相比之下，Oligo-MM¹²菌群中的粪肠球菌KB1拥有gfr同源物。

某些大肠杆菌菌株可通过其frl操纵子利用FL。为了研究两者是否存在对FL的竞争，研究人员在S. Tm感染前24小时，用能利用FL的野生型大肠杆菌Z1331或其缺失frl的突变体（Δfrl）预先定植LCM小鼠。结果显示，在感染后第1和2天，野生型大肠杆菌比Δfrl突变体能更有效地抑制S. Tm的肠道定植，但这种差异在后期消失。两种大肠杆菌菌株在小鼠肠道中的定植水平相当，表明生长抑制并非由Δfrl菌株的适应性缺陷造成。这证实了FL摄取系统在不同肠杆菌科菌株体内竞争中的作用。

3 讨论

饮食成分与肠道病原体定植间的相互作用至关重要。本研究揭示了美拉德反应产物FL通过Gfr系统在S. Tm SL1344肠道初始定植阶段发挥环境依赖性的促进作用。与在炎症后期起主要作用的果糖-天冬酰胺不同，gfr突变体的衰减主要发生在病原体与完整菌群竞争的最初几天。

FL并非一种最优的营养源。其果糖部分可被厌氧分解代谢，但赖氨酸部分可能仅用于蛋白质生物合成，因为其降解涉及多个氧化步骤，受到肠道还原环境的限制。在体内，FL充当了一般的碳源，并为蛋白质合成补充了赖氨酸池。赖氨酸是肠道中的限制性营养素，其进口和生物合成对生长都至关重要。

西方饮食中富含Amadori产物，可能通过影响微生物群落和病原体生长来调节肠道健康。其最终影响可能取决于饮食、宿主和微生物环境。炎症可能促进Amadori产物氧化碎裂成晚期糖基化终末产物（AGEs），而微生物群可能有助于限制其积累。未来的研究应探讨摄入Amadori化合物是否会独立地加剧肠道感染，并与慢性炎症和肠道功能障碍产生协同效应。

总之，研究表明，通过Gfr系统摄取果糖赖氨酸在S. Tm定植已 colonized 的肠道初期扮演了环境依赖性的角色。直接竞争者的存在会减少其定植，这表明使肠道菌群多样化，并结合饮食调整，可能有助于强化对入侵病原体的定植抗性。

4 材料与方法 （归纳总结）

本研究使用的细菌菌株和质粒列于附表S1。分子生物学操作采用λ-Red重组系统和P22噬菌体转导进行。动物实验使用了SPF C57BL/6J小鼠、LCM小鼠（定植了 altered Schaedler flora）、Oligo-MM¹²小鼠（定植12株细菌）和无菌（GF）小鼠。竞争性感染实验采用等量混合的条形码标记菌株，通过qPCR或Illumina测序分析粪便和器官中的竞争指数（C.I.）。FL通过化学合成，其存在通过LC-MS/MS在饲料和肠道内容物中验证。体外生长实验在厌氧条件下于M9最小培养基中进行，并使用¹³C标记的FL进行代谢通量分析，通过LC-MS检测同位素标记情况。