肠道菌群代谢物短链脂肪酸通过调控CYP1A1基因表达抑制结肠癌细胞的体外研究

《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：The effects of gut microbiota-derived short-chain fatty acids (SCFAs) on human colon cancer cells: An in vitro study

本研究针对结直肠癌(CRC)防治难题，探讨了肠道菌群代谢物短链脂肪酸(SCFAs)对Caco-2细胞CYP1A1基因表达的影响。研究人员通过不同浓度NaA、NaB、NaP处理细胞，发现SCFAs能显著上调CYP1A1表达并抑制细胞增殖，且该效应可被AhR拮抗剂CH223191逆转。结果表明SCFAs通过表观遗传调控发挥抗癌作用，为CRC防治提供了新策略。

在全球范围内，结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)因其高发病率和死亡率，一直是医学界面临的重大挑战。尤其值得注意的是，在伊朗等地区，结直肠癌的发病率上升趋势甚至超过了全球平均水平，这促使研究人员不断探索更有效的预防和治疗策略。近年来，随着微生物组学的飞速发展，科学家们将目光投向了人体内一个庞大的“隐形器官”——肠道菌群。数万亿的微生物栖息在我们的肠道中，它们不仅参与消化吸收，更在维持免疫平衡和代谢健康中扮演着关键角色。

当肠道菌群处于平衡状态（即“生态平衡”，eubiosis）时，它们能高效地将膳食纤维发酵成短链脂肪酸(Short-Chain Fatty Acids, SCFAs)，包括乙酸(acetate)、丙酸(propionate)和丁酸(butyrate)。这些小小的分子具有强大的生物活性：它们不仅是结肠上皮细胞的重要能量来源，还能调节免疫反应，发挥抗炎作用。然而，当肠道菌群失调(dysbiosis)时，SCFAs的产生会减少，这种保护作用就会被削弱，从而可能为癌症的发生发展创造条件。

在这项发表于《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》的研究中，来自伊朗伊斯兰阿扎德大学萨南达杰分校生物学系的研究团队深入探讨了SCFAs对人类结肠癌细胞的影响。他们特别关注了一个关键基因——CYP1A1（细胞色素P450 1A1），这个基因在外源性物质代谢和致癌物解毒过程中起着至关重要的作用。研究人员想知道，SCFAs是否能通过调控这个基因的表达来发挥其抗癌效应？

为了回答这个科学问题，研究团队设计了一套严谨的实验方案。他们使用了人类结肠癌细胞系Caco-2和HDF对照细胞系作为研究模型。主要技术方法包括：MTT法进行细胞活力检测，通过光密度(OD)值评估细胞增殖情况；实时定量PCR(Real-time PCR)分析CYP1A1基因的mRNA表达水平，使用2-ΔΔCT方法进行数据分析；Western blot蛋白质印迹技术验证CYP1A1蛋白的表达变化；以及统计学分析采用ANOVA检验，使用SPSS和GraphPad Prism软件处理数据。

3.1. 不同处理后Caco-2细胞的形态学评估与对照组比较

研究人员首先观察了经不同浓度SCFAs处理后的细胞形态变化。结果显示，与保持正常形态的对照组细胞相比，用NaA、NaB和NaP处理的细胞出现了明显的形态改变和细胞死亡。这种效应具有浓度和时间依赖性——浓度越高，处理时间越长，细胞变形和死亡现象越严重。特别是高浓度的NaB和NaP（30 mM）处理72小时后，引发了显著的细胞死亡，提示可能诱导了细胞凋亡机制。

3.2. MTT法结果

MTT实验结果提供了细胞活力的定量数据。NaA在30 mM浓度下，三个时间点（24、48、72小时）的光密度(OD)值均显著降低（p < 0.001），表明细胞活力受到明显抑制。NaB在15 mM浓度下处理24和48小时，以及7.5 mM浓度下处理72小时，也显示出OD值的显著下降。而NaP在30 mM浓度下处理24小时，同样观察到了细胞活力的显著降低。这些数据共同证明，三种SCFAs在特定浓度和时间条件下，都能有效抑制结肠癌细胞的增殖。

3.3. 实时定量PCR结果

3.3.1. Caco-2细胞中CYP1A1基因表达曲线的测量

基因表达分析显示，三种SCFAs处理均能改变CYP1A1基因的表达模式。研究人员建立了完整的检测体系，使用GAPDH基因作为内参，未处理样本的cDNA作为阳性外对照，无cDNA样本作为阴性外对照，确保了结果的可靠性。

3.3.2. 经NaA、NaB和NaP单独处理的细胞中CYP1A1基因的表达变化

具体分析发现，NaA、NaB和NaP在不同浓度和时间点对CYP1A1基因表达的影响各不相同。例如，7.5 mM和15 mM的NaB在24小时和48小时处理中显著提高了CYP1A1表达（p < 0.05），但30 mM的NaB反而降低了该基因的表达。类似地，NaP在多个浓度下都能上调CYP1A1表达，而高浓度长时间处理则显示出抑制作用。

3.3.3. 比较不同时间点经NaA、NaB和NaP处理的细胞中CYP1A1基因的表达

综合分析不同时间点的数据发现，在24小时处理期间，7.5 mM和15 mM NaB、各浓度NaP以及30 mM NaA均能增加CYP1A1基因表达。到了48小时，15 mM和30 mM NaA、7.5-30 mM NaP以及7.5-15 mM NaB继续显示出促进作用。72小时时，7.5-30 mM NaA和7.5-15 mM NaB仍能上调CYP1A1，但30 mM NaB和NaP则表现出抑制作用。这些结果表明SCFAs对CYP1A1的调控是复杂且条件依赖的。

3.4. 比较经NaA、NaB和NaP与CH223191抑制剂共同处理的细胞中CYP1A1基因的表达

为了验证SCFAs是否通过AhR（芳香烃受体）途径发挥作用，研究人员使用了AhR特异性拮抗剂CH223191。结果显示，10 μM CH223191单独处理能显著降低CYP1A1基因表达（p < 0.05），而2.5 μM的浓度则无此效应。当SCFAs与10 μM CH223191联合使用时，大多数情况下都观察到了CYP1A1表达的下调。然而，一个有趣的发现是：15 mM NaB与10 μM CH223191联合处理时，CYP1A1表达的下降程度不如其他组合明显，提示丁酸可能通过部分独立的机制发挥作用。

3.5. CYP1A1基因的表达变化与MTT法

将基因表达数据与细胞活力结果关联分析发现，CYP1A1基因表达水平与细胞死亡率之间存在正相关关系。当CYP1A1表达上调时，通常伴随着细胞增殖的抑制。例如，15 mM和30 mM NaA处理48小时既增加了CYP1A1表达，又降低了细胞增殖（p < 0.05）。类似地，7.5 mM和15 mM NaB也显示出相同的趋势。这些结果表明，SCFAs可能通过上调CYP1A1表达来抑制癌细胞生长。

3.6. 通过Western blot研究CYP1A1蛋白产物的变化

为了确认基因表达的变化是否在蛋白质水平得到体现，研究人员进行了Western blot分析。结果明确显示，在CYP1A1基因表达上调的处理组中，相应的蛋白质产量也增加了。例如，经15 mM NaB处理24小时的细胞、30 mM NaP处理24小时的细胞等，都显示出比对照组更强的CYP1A1蛋白条带。这一发现从蛋白质水平验证了SCFAs对CYP1A1的调控作用。

讨论部分深入分析了这些发现的意义。研究表明，SCFAs确实能够调控Caco-2细胞中CYP1A1基因的表达，且这种调控具有浓度和时间依赖性。在低于IC₅₀（半抑制浓度）的浓度下，增加SCFAs处理浓度会提高CYP1A1表达水平。然而，当浓度过高或处理时间过长时，细胞死亡效应占主导地位，基因表达反而下降。

这种双重效应揭示了SCFAs作为潜在抗癌剂的工作机制：在适宜浓度下，它们通过表观遗传调控（如抑制组蛋白去乙酰化酶HDAC）激活保护性基因如CYP1A1的表达，增强细胞对致癌物的解毒能力；而在高浓度下，则直接诱导细胞死亡。特别值得注意的是，丁酸（butyrate）显示出最强的效应，这与已知的丁酸作为天然HDAC抑制剂的特性相符。

研究结果与先前多项研究相互印证。例如，Forouzeh等人发现NaB能调节Bax和Bcl-2基因表达比例，诱导癌细胞凋亡；Marinelli发现特定菌株通过产生丁酸激活AhR信号通路；Jin等人报道SCFAs通过增强组蛋白乙酰化提高AhR诱导的基因表达。本研究通过综合运用分子和细胞生物学技术，为这一领域增添了新的证据。

然而，研究也存在一定局限性，如仅使用一种细胞系进行研究。未来研究可扩展至更多细胞模型，并建立动物实验体系，以更全面地评估SCFAs在体内的抗癌效果。

这项研究的重要意义在于它揭示了肠道菌群代谢物与结肠癌之间的分子联系，为开发基于微生物组的新型抗癌策略提供了理论依据。通过饮食干预调节肠道菌群组成，或直接补充SCFAs及其前体，可能成为预防和治疗结直肠癌的有效手段。特别是在个性化医疗日益重要的今天，根据个体肠道菌群特征定制营养干预方案，有望实现更精准的癌症防治。

研究结论明确表明，短链脂肪酸（乙酸钠、丁酸钠和丙酸钠）能够上调Caco-2细胞中CYP1A1基因的表达，这一效应在蛋白质水平得到验证。同时，SCFAs表现出明显的抗增殖和促细胞死亡作用。这些效应归因于SCFAs对组蛋白去乙酰化的抑制活性，证实了它们作为表观遗传调节剂的潜力。这些发现为将SCFAs开发为预防和治疗结直肠癌的表观遗传药物提供了新的视角和实验依据。